[发明专利]高灵敏度的突变基因检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测掺杂于野生型基因簇中的已知突变基因的方法。

背景技术

癌症是与心脏疾病、脑血管疾病并列的三大生活习惯病之一，是日本目前最大的死亡原因。癌症发生通常是构成人体的一部分细胞发生癌化，成为癌细胞而引起的。多数情况下，细胞的癌化是缘于与细胞分裂、细胞增殖等相关的基因的突变。这种成为癌症原因的基因突变多数情况是基因碱基序列上的一个碱基置换为其它碱基的点突变。

为了癌症的早期治疗，重要的是早期发现癌细胞。癌细胞的有无通常是由检体采集病理组织切片或细胞，在固定、染色后由细胞检验者等在显微镜下进行诊断。但是，这种病理诊断方法要求组织形态学的专业知识和技术，而且直到获得结果需要数天时间，且具有难以大量处理的技术问题。因此，近年来应用PCR法等基因扩增方法，开发了在基因水平迅速且简便地检测癌细胞的方法。可举出例如，将PNA（Peptide Nucleic Acid，肽核酸）、LNA（Locked Nucleic Acid，锁核酸）等核酸类似物用作引物、探针的突变基因检测方法。

PNA是指也被称为肽核酸的人工化学合成的核酸类似物。具有将由戊糖和磷酸构成的核酸基本骨架置换为以甘氨酸为单元的无电荷的多酰胺骨架的结构。与DNA、RNA相比，更为特异性且更强力地与具有互补碱基序列的核酸结合。另一方面，由于是化学合成物质，因而具有核酸聚合酶、核酸酶不作用的性质。利用这种性质，已知如非专利文献1所示，使用野生型ras基因特异性的PNA低聚物进行PCR法，由此抑制野生型基因，仅选择性扩增突变基因的方法等。

LNA是也被称为锁核酸的核酸类似物（专利文献1），是具有通过核糖核苷的核糖环的2’-氧与4’-碳间的亚甲基键形成环的结构的分子的总称。与PNA相同地，与具有互补碱基序列的核酸的亲和性高，与DNA、RNA相比，更为特异性且更为强力地结合。另一方面，与PNA不同的是，除了具有对核酸酶的敏感性之外，还可发挥作为核酸聚合酶的引物的功能。利用这种性质，也报道有如非专利文献2所示，使用LNA探针通过PCR法检测增大静脉血栓栓塞病发病率的V因子Leiden突变（Factor V Leiden mutation）的方法。

但是，通常由检体获得的细胞群体的大多数是具有野生型基因的正常细胞，仅极少掺杂具有突变基因的癌细胞。因此，即使进行采用了上述那样的基因扩增方法的突变基因检测方法，野生型基因的背景仍然高，故检测灵敏度低，而且结果的可靠性也不能说是充分的。因此，在实际临床中用作基因检查方面仍残留有许多问题。但是，这种从大量的野生型基因中检测突变基因的技术不仅对于癌症的早期发现，而且对于临床上癌症的治疗也具有极其重要的意义。其显著的实例是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer：以下记为NSCLC）的分子靶向药物吉非替尼（Gefitinib：商品名“イレッサ”Iressa、アストラゼネカ制造?销售）或埃罗替尼（Erlotinib：商品名“タルセバ”Tarceva、中外制药制造?销售）的敏感性。

NSCLS是占肺癌病例的约75%的疾病。由于进行性快，所以半数以上的患者在发现癌症时多数已经是不能手术的状态，而且死亡率也高。对于这类进行性肺癌，通常通过将使用了作为抗癌剂的铂制剂、多西他赛（Docetaxel）的化学疗法与放射疗法并用来进行治疗，但除了一部分病例之外，并未取得充分的效果（非专利文献3）。

以往抗癌剂的作用是广泛阻断DNA合成或细胞分裂，而吉非替尼、埃罗替尼却是以人上皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor：以下记为EGFR）为靶。EGFR在细胞外结构域与上皮生长因子（EFG）等配体结合时会形成二聚体，引起细胞内结构域的酪氨酸激酶活化。该活性引起自身磷酸化，激活下游的细胞内信号传导通路。从EGFR的活化参与细胞增殖、NSCLC患者的多数确认到EGFR基因的突变、并且NSCLC患者中观察到了EGFR蛋白质的过量表达等结果，认为EGFR基因的突变是NSCLC的发病原因之一。吉非替尼通过阻断EGFR的自身磷酸化而具有阻断信号传导的作用，因而被称为分子靶向剂。