[发明专利]高灵敏度的突变基因检测方法

权利要求书

1.突变基因检测方法，其是检测掺杂于基因库中的已知突变基因的有无的方法，该方法包括：

（1）使（1a）钳引物，其由与具有野生型基因的序列或野生型基因的互补序列的目标部位的全部或一部分杂交的PNA构成，

（1b）可以对包含具有突变基因的序列的目标部位的区域进行扩增的引物，与

（1c）前述基因库，

在基因扩增用反应液中共存，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的区域选择性地进行扩增的步骤；

（2）将前述步骤（1）中所得的扩增产物或其一部分作为模板，通过基因检测方法对包含突变基因的目标部位的检测区域选择性地进行检测，由此检测该突变基因的有无的步骤。

2.权利要求1所述的突变基因检测方法，其中前述步骤（2）是

使（2a）钳引物，其由与具有野生型基因的序列的目标部位的全部或一部分杂交的PNA构成，且具有与步骤（1）中所用钳引物（1a）相同或不同的碱基序列，

（2b）突变探针，其与具有突变基因的序列的目标部位的全部或一部分杂交，且序列的至少一部分由LNA构成，与

（2c）前述步骤（1）中所得的扩增产物或其一部分，

在基因扩增用反应液中共存，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的检测区域选择性地进行扩增，由此检测该突变基因的有无的步骤。

3.权利要求1所述的突变基因检测方法，其中前述步骤（2）是

使（2a’）钳引物，其由与具有野生型基因的互补序列的目标部位的全部或一部分杂交的PNA构成，且具有与步骤（1）中所用钳引物（1a）相同或不同的碱基序列，

（2b）突变探针，其与具有突变基因的互补序列的目标部位的全部或一部分杂交，且序列的至少一部分由LNA构成，与

（2c）前述步骤（1）中所得的扩增产物或其一部分，

在基因扩增用反应液中共存，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的检测区域选择性地进行扩增，由此检测该突变基因的有无的步骤。

4.权利要求2或3所述的突变基因检测方法，其中前述步骤（2c）中的基因扩增方法为PCR法。

5.权利要求2～4中任一项所述的突变基因检测方法，其中前述突变探针包含RNA。

6.权利要求2～5中任一项所述的突变基因检测方法，其中前述突变探针的一个末端被荧光物质所标记，另一个末端被抑制前述荧光物质的淬灭剂所标记。

7.权利要求2～5中任一项所述的突变基因检测方法，其中将前述突变基因的检测区域的扩增产物用核酸染色剂进行染色。

8.权利要求2～7中任一项所述的突变基因检测方法，其中通过荧光强度的增加来经时性地检测前述突变基因的检测区域的扩增产物的增加。

9.权利要求2～8中任一项所述的突变基因检测方法，其中前述突变为点突变。

10.权利要求2～8中任一项所述的突变基因检测方法，其中前述突变是缺失突变。

11.权利要求2～10中任一项所述的突变基因检测方法，其中前述钳引物的链长是14碱基～18碱基。

12.权利要求1所述的突变基因检测方法，其中前述步骤（2）中的基因检测方法为侵染法、TaqMan-PCR法、蝎形探针扩增法、DNA芯片法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、PCR-HRM法、gFCS法、Southern印迹法。

13.权利要求1～12中任一项所述的突变基因检测方法，其中前述突变基因为人上皮生长因子受体的突变基因。