[发明专利]包含额外的二硫键的人胰岛素

说明书

发明领域

本发明涉及包含额外的二硫键的人胰岛素和desB30人胰岛素及其制备方法。

发明背景

糖尿病是代谢病，在这种病中，使用葡萄糖的能力部分或完全丧失。在糖尿病的治疗中，已经提出并使用了许多种胰岛素制剂，如常规胰岛素、低精蛋白锌胰岛素(称为NPH)，胰岛素锌悬浮液(如Semilente?、Lente?和Ultralente?)以及两相低精蛋白锌胰岛素。

人胰岛素由两个多肽链组成，即A和B链，其分别包含21个和30个氨基酸残基。A和B链通过两个二硫键相互连接。来自大多数其它物种的胰岛素是相似的，但在一些位置可能包含氨基酸取代。在过去十年内，已经开发了许多人胰岛素类似物。它们是设计用于特定的作用模式，即快速作用或延长作用。包括这种胰岛素类似物的商业上可获得的产品包括Levemir?、NovoRapid?、Humalog?、Apidra?和Lantus?。

多种蛋白酶的作用使人胰岛素在胃肠道的内腔中迅速降解，限制了其吸收进入循环系统。当与天然胰岛素相比，亲水的并且对蛋白水解性降解稳定的胰岛素类似物在动物模型中表现出更高的生物利用度。

将二硫键引入蛋白是改善蛋白稳定性一种天然方式：已经发现二硫键的丰度和嗜热生物体间最高的生长温度之间的相关性，暗示了高温环境中二硫键在蛋白稳定中的重要性(Mallick P,等, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 9679-9684.:Ladenstein R,等, 2006, FEBS J., 273, 4170-4185)。也有许多成功地将二硫键工程化进蛋白并伴随稳定性增加的例子。对于芽孢杆菌RNAs获得了一种最高的稳定作用(Clarke J., Fersht A., 1993, Biochem., 32, 4322-4329)。通过增加解折叠(unfolding)所需的活化能，或者通过约束蛋白的解折叠的构象从而降低它们的构象熵，带来了这种稳定作用(Pace C.N., 1990, Trends Biol.Sci.,14-17)。然而，在这个新兴的研究领域，需要学习的多得多。至今，没有胰岛素中工程化的二硫键的报道。

仍然需要稳定的新型人胰岛素类似物。

发明概述

本发明涉及具有两个或更多个半胱氨酸取代的人胰岛素类似物，其中保留人胰岛素的三个二硫键，选择半胱氨酸取代的位点的方式使得引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成。

在一个方面，获得了本发明的人胰岛素，其中选择半胱氨酸取代的位点的方式使得(1)引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，以及(2)人胰岛素类似物保留了与人胰岛素相关的所需的生物活性。

在一个方面，获得了本发明的人胰岛素，其中选择半胱氨酸取代的位点的方式使得(1)引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，(2)人胰岛素类似物保留了与人胰岛素相关的所需的生物活性，以及(3)人胰岛素类似物相对于人胰岛素和/或母体胰岛素增加了物理稳定性。

在一个方面，获得了本发明的人胰岛素，其中选择半胱氨酸取代的位点的方式使得(1)引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，(2)人胰岛素类似物保留了与人胰岛素相关的所需的生物活性，以及??(3)人胰岛素类似物对蛋白水解性降解是稳定的。

本文还描述了用于稳定人胰岛素的方法，包括以半胱氨酸残基取代人胰岛素或desB30人胰岛素的两个或更多个氨基酸，其中保留所述人胰岛素的三个二硫键，选择半胱氨酸取代的位点的方式使得引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，从而获得了包括不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的人胰岛素类似物。

发明内容

在本发明中，提供了新的人胰岛素类似物，其中将二硫键工程化进胰岛素。

在一个方面，本发明的人胰岛素类似物具有两个或更多个半胱氨酸取代，保留了人胰岛素的三个二硫键。

在本发明的一个方面，选择半胱氨酸取代的位点的方式使得引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成。