[发明专利]从蜡包埋样品中提取核酸

说明书

本发明涉及从蜡包埋样品中提取核酸的方法。特定溶剂在从交联蜡包埋样品中提取、分离和/或纯化核酸的方法中用于从蜡包埋样品中脱蜡的用途，以及用于从蜡包埋样品中提取、分离和/或纯化核酸的试剂盒。

从活生物体中取出的生物材料如组织、组织碎片或分离细胞，若不使用常规方法，例如，孵育于营养介质，后者将于短期后死亡。已死亡的细胞还快速进行初始的自溶性发酵，然后是细菌降解，致使初始的“组织中的细胞”这一结构被破坏。因此，如果想对取出的生物样品进行组织学检查，那么有必要固定所述样品以抑制其分解。采用固定的方式是为了将生物结构基本保存为生命样形态，以使“真实评价”可行。固定的另一个优势在于样品可作为档案长期保存这一事实。并且，许多形态学考察只可在已固定材料的基础上进行。

通常采用沉淀或交联化合物如酸、醇、酮或醛来完成固定，尤其是甲醛(一般使用4–10wt.-%或35wt.-%的水溶液形式，两者都称为“福尔马林”)，然后通常用蜡，常用石蜡(所谓“福尔马林固定，石蜡包埋”，(FFPE)材料)包埋固定材料。使用包埋介质的主要目的是，使样品可在自然状态下进行切片和安放，以供显微和/或组织学应用。然而，对于多数应用，例如在对样品进行组织学染色之前，从样品中脱去包埋介质是必要或至少是有益的。

脱石蜡的常规方法包含使用芳香族溶剂如甲苯，特别是二甲苯。通常将新鲜切片或安放于显微载片的样品浸入二甲苯浴直至石蜡溶解。在后续步骤中，用醇浓度递减的一系列醇溶液洗涤脱石蜡样品以去除二甲苯，然后用水进行最后洗涤，使得样品与水性的反应物/试剂溶液如裂解缓冲液或染色溶剂相容。可是，二甲苯是可燃、挥发性且有毒的有机溶剂。因此，在过去几年中，为采用较低毒性的脱石蜡剂替换二甲苯，人们做了大量的努力。组织学应用中，替换二甲苯的例子包含萜油，如d-柠檬烯、异石蜡烃类或水性洗碟用皂液(R.J.Buesa,M.V.Peshov,Annals of Diagnostic Pathology 2009,13,246-256)。

就脱蜡而言，这些脱石蜡剂中的一些与二甲苯水平相当，但毒性较低甚至无毒。然而，为了在用水洗涤以实现与多数类型的免疫组化染色相容之前去除溶剂/脱石蜡剂，很多情况仍需要进行一系列醇洗涤。随着生物分子技术的发展，对于蜡包埋样品尤其是FFPE样品不单进行光学显微检察，还分析其中所得核酸(DNA和RNA)已日渐重要。对从此类样品获得的核酸可利用高度灵敏的技术如聚合酶链反应(PCR)进行后续分析。然而，如果作为免疫组化染色的替代或补充，考虑从蜡包埋样品中提取核酸，那么，脱石蜡剂不干扰任何后续的核酸浓缩、纯化、分离和/或分析步骤，或者该试剂可在样品脱石蜡后被完全去除，是非常重要的。

为了从FFPE样品回收核酸，所述样品通常使用二甲苯脱蜡，再用醇浓度递减的醇溶液洗涤数次，随后在适当的消化缓冲液裂解。在后续步骤中，常采用有机提取法如苯酚/氯仿提取来从这些缓冲液中提取核酸，并任选利用如乙醇或异丙醇来沉淀而进一步浓缩核酸。

若使用包含如硫氰酸胍的离液消化缓冲液，或者在消化/裂解步骤后添加离液剂至样品，所述核酸也可通过固相选择性结合核酸的方式来分离，例如二氧化硅膜或玻璃珠，由此避免上述使用毒性溶剂的液/液提取步骤。另一方面，离液物质也被认为是有毒的。

为尽量减少毒性物质用量以及洗涤步骤次数，已开发了若干市售可得的试剂盒用于分离核酸(包括DNA和RNA)，其中大多数采用二甲苯作为脱石蜡剂，尽管包含例如以萜类作为脱石蜡剂的试剂盒同样可得(J.B.A.Okello AnalyticalBiochemistry 2010,400(1),110-117)。来自TG公司(TrimGen，美国马里兰州斯帕克斯)的市售无蜡石蜡样品制备试剂盒中采用另一方法。使用专有溶液脱蜡后，在样品中加入一种特殊树脂和一种酶混合物。所述酶混合物消化样品，而潜在的PCR抑制剂与所述树脂结合，可在PCR扩增前容易地从样品去除。

虽然使用该试剂盒可在基于PCR扩增FFPE组织回收所得核酸中获得良好结果，但是该方法可能并不适合其它后续分析步骤。另外，所述树脂适应于消化混合物和脱蜡溶液中所存在的特定成分。因此，所述试剂盒不能与任意裂解缓冲液结合使用。

所以，本发明所要解决的问题是提供从蜡包埋样品中提取核酸的方法，该方法既不需要有毒脱石蜡剂，繁复的洗涤步骤，又不需要特别适应于捕获样品中污染物或PCR抑制剂的树脂。