[发明专利]从蜡包埋样品中提取核酸

权利要求书

1.一种从蜡包埋样品中提取核酸的方法，所述方法包含以下步骤：

1.使样品接触蜡增溶剂，所述蜡增溶剂包含至少一种与水不混溶的有机溶剂，

2.任选地孵育步骤1所得的混合物，

3.向仍含有蜡增溶剂的混合物中加入水性裂解缓冲液，

4.孵育步骤3所得的混合物以得到一种双相或多相混合物，所述混合物包含至少一个有机相和一个水相，所述有机相主要含有溶蜡和所述蜡增溶剂，所述水相含有核酸，

其中步骤1和3也可作为一个合并步骤来进行。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包含以下步骤：

5.任选将所述有机相与所述水相分离，

6.从所述水相分离和/或纯化核酸。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述样品为石蜡包埋样品，优选为福尔马林固定石蜡包埋样品(FFPE样品)，并且所述蜡增溶剂包含至少一种有机溶剂，所述有机溶剂优选选自直链、支链和环状的C10-C16烷烃或其混合物，更优选选自C13-C16烷烃或其混合物，最优选代表十四烷、十五烷或十六烷。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述蜡增溶剂可包含染料/着色剂。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2所述的孵育蜡增溶剂和蜡包埋样品的混合物的步骤在15-85°C的温度范围下进行，优选20-55°C，更优选室温至35°C，最优选室温；孵育时长优选1秒至3小时，更优选10秒至1小时，更优选20秒至30分钟，最优选30秒至15分钟。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述裂解缓冲液包含缓冲试剂和去污剂，所述缓冲试剂优选选自Trips，Mops，Mes，Hepes，磷酸盐，硼酸盐，碳酸盐，所述去污剂优选选自阴离子和两性离子去污剂。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述裂解缓冲液还包含选自螯合剂、还原剂、无机盐pH指示剂及稳定剂的一种或多种物质；且所述裂解缓冲液的pH优选于4-11范围内，优选7-10，最优选8-9。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤3中在添加所述裂解缓冲液以外还向所述混合物中加入蛋白水解剂或者步骤3中加至所述样品的裂解缓冲液中已包含蛋白水解剂，所述蛋白水解剂选自蛋白酶和非酶促蛋白水解化合物，优选代表蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶、胞内蛋白酶Lys-C、溴化氰、重组芽孢杆菌蛋白酶、溶菌酶或其混合物。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4所述的将水性裂解缓冲液加入样品后所得混合物的孵育步骤在15-95°C的温度范围下进行，优选20-70°C，最优选37°C-65°C；孵育时长优选30秒至24小时，优选50秒至12小时，更优选50秒至5小时，最优选1分钟至2小时。

10.如权利要求2-9中任一项所述的方法，其特征在于，步骤6所述的分离和/或纯化包含在水相中的核酸的步骤至少通过层析和/或基于固相的方法来进行，优选选自凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、反相色谱法和无离液剂的亲和结合法。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述裂解缓冲液含有阴离子表面活性剂离子，所述阴离子表面活性剂离子在步骤4所述的孵育后通过使用单价碱金属离子和/或二价碱土金属离子来沉淀而从所述样品中基本去除，所述金属离子优选选自Rb+、Cs+、Ca2+、Sr2+、Ba2+或其混合物；然后从水相分离和/或纯化核酸，优选通过凝胶过滤层析法来进行。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸选自核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)，优选DNA，更优选于长度至少有100bp的DNA。

13.选自直链、支链和环状的C10-C16烷烃或其混合物的溶剂在从交联蜡包埋样品提取、分离和/或纯化核酸的方法中用于从蜡包埋样品中脱蜡的用途，所述溶剂更优选选自C13-C16烷烃或其混合物，最优选代表十六烷，所述交联蜡包埋样品优选FFPE样品，其中裂解样品中交联的步骤在一种或多种所述溶剂和水性裂解缓冲液的双相或多相混合物中进行。