[发明专利]使用具有编码肽酶的基因的减弱表达的肠杆菌科的细菌产生L-氨基酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物工业，并具体涉及产生L-氨基酸，如L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-赖氨酸的方法。本方法使用经修饰减弱编码肽酶的基因的表达的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌。

背景技术

常规地，L-氨基酸在工业上通过利用来自自然来源的微生物菌株或其突变体的发酵方法产生。通常，所述微生物经修饰而增强L-氨基酸的生产收率。

已报道了许多增强L-氨基酸生产收率的技术，包括通过用重组DNA(参见，例如美国专利号4,278,765)转化微生物。其他增强生产收率的技术包括增加涉及氨基酸生物合成的酶的活性，和/或使由产生的L-氨基酸造成的反馈抑制的靶酶脱敏(参见，例如，WO95/16042或美国专利号4,346,170；5,661,012和6,040,160)。

其它增强L-氨基酸生产收率的方式是减弱一种或几种涉及靶L-氨基酸的降解的基因，使靶L-氨基酸的前体从L-氨基酸的生物合成途径转向的基因，涉及碳、氮和磷通量的重新分配的基因，以及编码毒素的基因等的表达。

来自大肠杆菌(Escherichia coli)的pepA基因(同义词carP)编码组合了催化和调节特性的多功能酶氨肽酶A(PepA)。已显示：除了水解蛋白质的N端氨基酸残基之外，还需要氨肽酶A进行位点特异性DNA重组和质粒多聚体的单体化(monomerization)(Stirling等(1989)EMBO J.,8,1623-1627;Charlier等(1995)J.Mol.Biol.,250,392-406)。另一种氨肽酶A功能是转录调节。PepA是DNA结合蛋白，并涉及调控氨甲酰磷酸合酶的合成的carAB操纵子的转录抑制(Roovers等,(1988)J.Mol.Biol.,204,857-865)。氨甲酰磷酸是L-精氨酸和嘧啶生物合成途径的中间体。氨甲酰磷酸和L-鸟氨酸之间的相互作用导致L-瓜氨酸形成，其通过L-精氨琥珀酸转化为L-精氨酸。

来自大肠杆菌的pepB基因(同义词yhfI，b2523,ECK2520)编码氨肽酶B(PepB)，其为大肠杆菌中的四种半胱氨酰甘氨酸酶(cysteinylglycinase)之一。氨肽酶B在体外切割Leu-Gly，Leu-Gly-Gly，Cys-Gly和Leu-Gly(Miller等(1994)Journal of Bacteriology,176,610-619,Hermsdorf等(1979)International Journal of Peptide and Protein Research,13,146-151,Suzuki等(2001)Bioscience.Biotechnology.Biochemistry.,5,1549-1558)。在体内，氨肽酶B与氨肽酶A和N，以及二肽酶D一起，为四种半胱氨酰甘氨酸酶之一(Suzuki等,(2001)Journal of Bacteriology2001;183(4)1489-1490)。二价阳离子，包括一些并非活性的有效刺激剂的，稳定化氨肽酶免受热失活(Suzuki等(2001)Bioscience.Biotechnology.Biochemistry.,5,1549-1558.)。

来自大肠杆菌的pepD基因(同义词pepH，肌肽酶)编码肽酶D，其为能够分解多种具有未封闭的(unblocked)N端的二肽，包括半胱氨酰甘氨酸的二肽酶(Schroeder等,(1994)FEMS Microbiology Letters,123,153-159,Suzuki等,(2001)Journal of Bacteriology,183,1489-1490)。肽酶D作为PepD单体的二聚体起作用(Klein等,(1986)Journal of General Microbiology,132,2337-2343)。在磷酸盐饥饿过程中，pepD的转录增加至五倍(Henrich等,(1992)Molecular General Genetics,232,117-125)。

然而，目前并无减弱编码肽酶的基因的表达用于产生L-氨基酸，如L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-赖氨酸的报道。

本发明的公开

本发明的诸方面包括增强能够产生L-氨基酸，如L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-赖氨酸的菌株的生产率，并提供使用这些菌株产生此种L-氨基酸的方法。