[发明专利]电化学检测结合反应的方法

说明书

本发明涉及一种直接且高灵敏度的电化学检测溶液中的抗体-抗原结合反应和其他生物化学相互作用的方法。所述方法适用于诊断中不含洗涤且不含分离的免疫测定，特别适用于自动化及微流体免疫测定。所述方法还适用于廉价的免疫测定系统和一次性使用的测试条。

免疫测定使用抗原-抗体反应以特异性检测复杂介质如血液、血清、尿或食品中最小浓度的分析物。几十年来，免疫测定已成为临床诊断、环境分析和食品分析中不可缺少的工具，用于检测最小浓度的激素、代谢物、蛋白质、生物标记、毒素、杀虫剂、病原菌和病毒。许多最重要的临床-诊断分析物仅用免疫测定可廉价且快速地测量，因为没有提供高灵敏度(检测纳摩尔或更低浓度)和高特异性(在具有化学相似结构的干扰物质的存在下检测分析物)的相当组合的备选分析化学方法。备选方法如色谱法(例如HPLC、气相色谱法)常需要多步样品制备，例如通过提取和化学衍生化进行制备。

自50年前Rosalyn Yalow和Salomon Berson发明免疫测定以来，已开发了许多不同的实施方案，被称为不同的免疫测定形式(format)。异相形式如ELISA(酶联免疫吸附测定)与均相形式之间的根本区别建立在用于检测的抗体的聚集状态的基础上：在异相测定中，将抗体(较少见的是抗原)固定在表面(反应管、微量滴定板、测试条)上；所有反应步骤(如洗涤和分离步骤，如检测)同样在该表面上进行。在均相形式中，不将任何结合配偶体(binding partner)固定，无需洗涤和分离步骤，并且检测同样在溶液中进行。

区分的另一可能性来自使用的检测方法。因为不可能使得抗体-抗原结合反应直接可见，所以结合配偶体之一必须与分子标志物(marker)或“标记(label)”化学偶联(例外：基于表面等离子体共振的质量敏感型生物传感器、光栅耦合器、石英晶体微天平、表面声波以及实时直接测量分子结合反应的相似技术(如果结合配偶体之一固定在敏感表面上)。然而，这些方法迄今仅用于研究应用而不是常规分析中)。合适的标记必须具有高“比活度”，即每个标记分子必须产生尽可能多的信号传导事件。最常用的标记包括放射性同位素(放射免疫测定，“RIA”)、荧光染料(荧光素、罗丹明等)、荧光半导体纳米颗粒(“量子点”)、聚合物纳米颗粒(“胶乳珠”，团聚免疫测定)以及酶如过氧化物酶，连同比色、荧光或化学发光酶底物(ELISA)。放射性同位素具有最高的比活度，甚至允许检测单个标记分子。由于来自放射性的健康危害，相关的高实验室要求(“同位素实验室”)和高成本的残余物处置，因此放射性免疫测定逐渐被备选方法如ELISA代替。

不同免疫测定之间的另一区别由使用的抗体类型所致。抗体为具有复杂结构的蛋白质，其具有决定结构并在所有抗体类别中具有相似组成的恒定区以及形成抗原结合位点的高度可变区。最初使用的包含多种具有可变的特异性和亲和力的抗体的多克隆血清在许多应用中被单克隆抗体代替，所述单克隆抗体确切地仅包含一种具有明确定义的特异性和亲和力的抗体实体(“克隆”)。理论上，可以制备任意量的具有相同性质的单克隆抗体。此外，可以通过酶消化从完整抗体制备的所谓的抗体片段也用于一些分析。单链抗体是可以通过遗传工程方法制备的重组抗体片段。原则上，所有类型的抗体以及由其衍生的分子结合剂(molecular binder)均可以用于已知的免疫测定形式中。

公知的可以用免疫测定检测的临床分析物包括hCG (妊娠试验)、甲状腺激素如TSH(甲状腺病)、类固醇激素(内分泌学、能育性)和PSA(前列腺癌的生物标记)。

总体而言，可以说基于单克隆抗体或多克隆抗血清的免疫测定是生物技术、临床诊断、环境分析和食品分析的最重要的分析化学方法，并且具有高商业价值。

现有技术记载了多种进行免疫测定的方法。大多数异相免疫测定需要几个人工过程，例如移液步骤、样品稀释、洗涤步骤，它们必须按照确切的时间方案。因此，通常需要为这些过程特别配备的专门人才和实验室以正确进行这样的测定。需要的检测装置(“酶标仪”、微量滴定板读数器、免疫测定分析仪)昂贵且不便于携带。例如，进行ELISA测试的方案描述于专利[US4016043A、US3839153A]中。本领域技术人员容易地认识到这样复杂的分析方法仅可以由专门人才进行，并且仅可以在合适的实验室环境中进行。这样的方法的自动化是非常艰巨的，并且需要高度复杂的自动机。