[发明专利]植入前遗传筛查用的比较性基因组杂交阵列方法有效
申请号: | 201180024202.4 | 申请日: | 2011-02-28 |
公开(公告)号: | CN102892904A | 公开(公告)日: | 2013-01-23 |
发明(设计)人: | A.克雷格;A.布朗;N.哈恩 | 申请(专利权)人: | 蓝色地精有限责任公司 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68;G01N33/58;C40B40/06;C40B70/00;C12N15/11 |
代理公司: | 北京市柳沈律师事务所 11105 | 代理人: | 闵丹 |
地址: | 英国*** | 国省代码: | 英国;GB |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 植入 遗传 筛查用 比较 基因组 杂交 阵列 方法 | ||
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年3月16日提交的美国专利申请12/724,865的权益,其全部内容通过引用并入本文。
领域
本发明涉及用于检测胚胎、卵母细胞、极体或相关活检物的细胞内遗传异常的方法。
背景
在IVF(体外受精)领域中,希望在胚胎植入前鉴定胚胎细胞中的染色体数量和染色体组。越来越多的证据表明影响胚胎存活率的最重要因素之一是染色体不均衡,包括拷贝数增加/损失和整个染色体的非整倍体(染色体数目异常)。
当前的测试方法首先涉及代表被测试胚胎的遗传物质的分离。非整倍体分析中目前使用的样本是与卵母细胞相关的极体切片、来自卵裂球切片(与第3天胚胎相关)的单细胞、或囊胚滋养层细胞切片(与第5天胚胎或囊胚相关)。但在某些情况下,在过程中的其他点或多个点采集的样品经证明更有效。然后通过多种方法对极体或细胞进行测试来检测拷贝数的不均衡。虽然文献中经常见到的术语是PGD,但考虑到本申请的目的,还是把这类测试方法简称为胚胎植入前遗传筛查(PGS)。名词PGS还应当包括测试极体来评估卵母细胞的质量从而例如保证信息可靠的卵子库服务。
比较基因组杂交(CGH)技术已被用于检测基因组DNA中是否存在被扩增或删除的序列(对应所谓拷贝数的变化)以及它们的位置。一般来说,基因组DNA分离自正常的参照细胞,也分离自测试细胞。将两个核酸样品差异标记,然后与参照细胞的中期染色体原位杂交。参照和测试DNA中的重复序列被去除,或者通过某些手段降低它们的杂交能力。通过检测来自两个DNA的信号比率改变的区域,可以识别测试细胞中拷贝数增加或减少的染色体区域。这类拷贝数变化的区域的检测对诊断遗传疾病尤其重要。
如以上描述的中期CGH已被采用并且有能力筛查所有染色体中的异常。为了将CGH分析应用到PGS环境,需要在分析前将整个基因组扩增从而使DNA的量从单个细胞(5-10pg)增加到适合中期CGH(1μg)的水平。常用的扩增方法包括DOP-PCR (Telenius et al,1992),或者更近期的全基因组扩增试剂盒,比如GENOMEPLEX(Rubicon genomics)和REPLI-G(Qiagen)。临床情景中使用细胞分裂中期CGH的主要问题是它可能需要大约4天来完成,在不进行后续周期中的胚胎冷冻和植入的情况下,这与IVF中胚胎植入前所需的时间框架不相容。此外,该方法技术上颇有挑战性,需要较高的专业水平来实施和分析。这些困难限制了中期CGH在PGS中的广泛使用。
Pinkel等人在1998和2003年公开了已广为人知的阵列比较基因组杂交的技术,以下简称为arrayCGH。1998年,Solinas-Toldo等人描述了类似的“基于矩阵的比较基因组杂交”方法。
arrayCGH技术就利用双链DNA的结合特异性方面来说,与CGH依赖于相似的分析原理。在arrayCGH中,参照细胞的中期染色体被可能数以千计的固体支持物结合的未标记靶核酸(探针)集合所取代,例如,已经被置入染色体特定位置的克隆的阵列。因此ArrayCGH是一类高通量检测两个DNA样本之间拷贝数差异的比较技术,其中所述两个DNA样品与相同的杂交区域杂交。它比CGH具有的优势是它能达到更高的分辨率,并且在拷贝数检测很重要的其他领域之外,还能够应用于由拷贝数变化所诱发的遗传性疾病的检测和诊断。虽然细节有所不同,可以使用多种不同的探针类型,包括在寡核苷酸、PAC和细菌人工染色体(BAC)阵列中遇到的探针类型。
ArrayCGH目前被用于在体质细胞遗传学中协助临床医务人员研究基因组不均衡,并且越来越多地用于癌症研究。这些应用有着令人难以置信的要求,要求为这些应用设计的微阵列的生产标准比那些用于学术或临床前研究应用的微阵列的标准严格得多。
ArrayCGH相对中期CGH所具有的优点在于解释更简单并且容易实现自动化;此外完整分析所需要的时间更短。ArrayCGH可用于检测单个细胞中的非整倍体,并已成功地应用于PGS。对这项技术,必须将单细胞扩增,采用那些与中期CGH使用的方法相同的方法。ArrayCGH允许在48小时内完成整个基因组的全面分析,这使得在不需要PGS中细胞冻存的情况下进行非整倍体筛查。
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