[发明专利]试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明涉及实时地均质(即非固相)测定样品中的一或几种脱氧核糖核苷激酶的试剂盒和方法，其用于诊断疾病、失调、感染(病毒性和细菌性)或癌症。

发明背景

脱氧核糖核苷激酶

真核细胞中存在至少三种脱氧核糖核苷激酶，胸苷激酶1和2(TK1和TK2)、脱氧胞苷激酶(dCK)和脱氧鸟苷激酶(dGK)。

存在着编码两种不同胸苷激酶的两种人类基因座。可以在细胞的胞浆中发现胸苷激酶。胸苷激酶2定位于线粒体并参与线粒体DNA合成。TK2具有与胸苷激酶1不同的氨基酸序列、底物特异性和表达谱。

从细胞周期的G1期末期开始和贯穿S期，胸苷激酶1的活性最为明显。TK和dCK负责通过补救途径调节细胞中的TTP和dCTP池。所述TK酶在三磷酸腺苷(ATP)的存在下催化胸苷向单磷酸胸苷(TMP)转化。

在整个细胞周期都发现脱氧胞苷激酶的活性，并且主要在淋巴来源的细胞中鉴定到其活性。TK2定位于线粒体中并与dCK具有对dC几乎相等的亲和力。

疾病的诊断

在20世纪80年代早期，表明胸苷激酶活性不仅可以从受各种肿瘤疾病影响的患者的血清中检测到，而且与健康人类个体(其中通常表现出非常低的TK活性)有广泛的差异。

目前广泛接受使用TK作为血液癌症疾病诊断和预后的单一肿瘤标记物。在某些情况下，TK已显示出直接的诊断能力。

TK和其他脱氧核糖核苷激酶的活性早已与疾病相关联，这由Eriksso等人(2002)和由Topolcan与Holubec(2008)在综述中有所总结。

已将TK2和线粒体疾病相联系。

检测脱氧核糖核苷激酶的测定

放射性底物，如³H-胸苷，已被广泛用于在过滤结合测定中确定TK和dCK的活性。对于常规的临床诊断，基于放射性的测定不是个有吸引力的选择。

在最近几年中，已作过几种尝试以开发不基于放射性的测定，所有这些测定在一个方面或其他方面更好。以下是在不同的脱氧核糖核苷激酶的检测中所使用的一组方法、测定和试剂组合物。

在EP1385005中，提出基于叠氮胸苷(AZT)的竞争性单磷酸化的不基于放射性的TK活性测定。这项技术已由Diasorin S.r.l.进一步开发成自动的两步骤的发光诊断测定。在该两步的测定中，首先由样品中存在的TK将AZT磷酸化为单磷酸化的AZTMP。接着从缀合至异氨基苯二酰肼(AZTMP ABEI)的AZTMP检测发光，所述缀合至异氨基苯二酰肼的AZTMP与固体表面底物上的TK磷酸化AZTMP竞争结合抗AZTMP抗体。该两步骤测定的主要缺点是动态读取受限。另一缺点是使用修饰的核苷底物代替天然的胸苷。

在WO2009/063254中公开了通过使用单磷酸化的Br-dU的用于确定样品中TK活性的半均质方法，所述单磷酸化的Br-dU通过HPLC分离并通过UV检测。该方法的缺点是用修饰的底物进行所述反应和以分离步骤进行检测。

US2008/248472公开了固相测定，其通过试剂混合物中的脱氧核糖核苷激酶互补样品中TK活性以产生Br-dUTP(天然TTP的衍生物)。随后使用RNA依赖的DNA聚合酶通过引物延伸掺入所述Br-dUTP。固相结合的RNA模板由单体rA建成，长200-400个单体，并被连至固相。在ELISA中使用碱性磷酸酶缀合的抗[Br]dU抗体在第二步骤检测掺入的[Br]U来最终确定TK活性。用许多手动交互步骤进行这个两步骤的测定是繁琐的并且执行所述测定花费过长的时间。

尚未提出用于测量样品中dCK活性的可靠的检测。

附图简述

图1显示了产生TTP和dCTP的补救途径

图2显示了根据本发明的方法的检测系统2的原理

图3显示了根据本发明的方法的检测系统3的原理

图4显示了根据本发明的方法的检测系统1的原理

图5通过实时荧光捕获获得的荧光曲线获得实施例3的hrTK1标准点的阈值水平Ct。

图6实施例3的hrTK1标准点的平均Ct值在对数标度上的线性回归。

图7实施例4的hrdCK标准点的平均Ct值在对数标度上的线性回归。

图8实施例7多重hrTK1与hrdCK在对数标度上的线性回归。