[发明专利]稳定化的纤连蛋白结构域组合物、方法和使用

说明书

背景技术

技术领域

本发明涉及具有新性质的蛋白质支架，所述新性质包括结合细胞靶标的能力。更具体而言，本发明涉及基于III型纤连蛋白(FN3)重复序列的共有序列的蛋白质支架。

关于本领域的讨论

当靶标分子需要具有高亲和性和特异性时，单克隆抗体是最广泛使用的治疗性蛋白质类型。但是，可被工程改造成结合这种靶标的非抗体蛋白质在生物医药行业中也具有很大的重要性。这些“另类的支架”蛋白质可具有优于传统抗体的优点，因为它们尺寸小、缺乏二硫键、稳定性高和能够在原核生物宿主中表达。新纯化方法是可容易应用的；它们容易地缀合至药物/毒素，有效穿透到组织内，并且容易地格式化成多特异性结合物(Skerra2000 J Mol Recognit(《分子识别杂志》)13(4)：167-87；Binz和Pluckthun2005 Curr Opin Biotechnol(《生物技术近期述评》)16(4)：459-69)。

一种这样的另类支架是免疫球蛋白(Ig)折叠。这个折叠存在于抗体以及数千种非抗体蛋白质的可变区。已证实，一种这样的Ig蛋白，即人纤连蛋白的第十个III型纤连蛋白(FN3)重复序列，能容忍表面所暴露的环中的许多突变而保持总体的Ig折叠结构。因此，已建立了这些环的氨基酸变体的文库，并选择出了针对多个不同靶标的特异性结合物(Koide等人，1998 JMol Biol(《分子生物学杂志》)284(4)：1141-51；Karatan等人2004 ChemBiol(《化学生物学》)11(6)：835-44)。已发现这种经工程改造的FN3结构域以高亲和力结合靶标，同时保持重要的生物物理性质(Parker等人，2005 Protein Eng Des Sel(《蛋白质工程、设计与选择》)18(9)：435-44)。

潜在的另选支架分子的合乎需要的物理性质包括热稳定性高以及热折叠和解折叠之间可逆。已应用了几种方法来提高蛋白质和酶的表观热稳定性，包括基于与高度相似的热稳定性序列的比较进行的合理设计、稳定化的二硫桥的设计、增加α-螺旋倾向的突变、盐桥的工程改造、蛋白质表面电荷的变更、定向进化和共有序列的组成(Lechmann和Wyss 2001 Curr OpinBiotechnol(《生物技术近期述评》)12(4)：371-5)。高热稳定性是这种支架的期望性质，因为它可提高所获得的重组蛋白质的产率，改善纯化的分子的可溶性，改善细胞内支架的活性，降低免疫原性和尽可能减少在制造中需要冷链。

发明内容

本发明提供基于III型纤连蛋白(FN3)重复序列蛋白的蛋白质支架、编码核酸或互补核酸、载体、宿主细胞、组合物、组合、制剂、装置、及其制备和使用方法。在一个优选的实施例中，蛋白质支架由来自人生腱蛋白C(下文称“生腱蛋白”)的多个FN3结构域的共有序列组成。在又一个优选的实施例中，本发明的蛋白质支架是15个FN3结构域的共有序列(SEQ ID NO：1-15)或其变体。在本发明的一个特定方面，本发明的蛋白质支架具有取代残基，所述取代残基引起该支架蛋白显示出抵抗热和化学变性的能力增强。本发明的蛋白质支架可以通过本领域已知的方法进行工程改造，包括在支架内的指定环区域处插入残基，以形成对于结合配偶体选择性的结合结构域。结合配偶体可以是可溶分子或细胞锚定分子，例如受体蛋白质的细胞外结构域。

在一个实施方案中，本文描述的就固有热和化学稳定性选择的SEQ IDNO：16(Tencon)的基于共有区的序列中的特异性取代使Tencon支架的热稳定性改善高达11℃，并且使GdmCl诱导的变性的中点从3.4M转变为大于5M。在一个实施例中，对于SEQ ID NO：16(Tencon)的特异性取代是单一的，例如N46V、E14P和E86I，并且在一个另选的实施例中，取代是多重的，例如N46V和E86I、E14P和N46V和E86I中的全部、以及L17A和N46V和E86I中的全部。稳定性增强的基于Tencon的多肽提供具有改善的易于纯化、制备和增加的储存期限的支架。通过将随机化的肽引入稳定化的支架的环内，可以产生总体稳定性改善的经工程改造的结合配偶体。