[发明专利]稳定化的纤连蛋白结构域组合物、方法和使用

权利要求书

1.一种包含基于支架的分子的多肽，所述基于支架的分子包含拓扑类似于第三个纤连蛋白结构域的结构域的环结构域，所述多肽具有基于第三个纤连蛋白结构域的共有序列的氨基酸序列，所述第三个纤连蛋白结构域具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 16的特定残基被替换，并且增强所述基于支架的分子的热稳定性和化学稳定性。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述热稳定性通过差示扫描量热法作为解链温度(Tm)进行测量，并且所述化学稳定性通过对氯化胍变性的抗性作为[D]进行测量。

3.根据权利要求2所述的多肽，其中与具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的所述基于支架的分子相比较，所述Tm从约1千卡增加到约12千卡。

4.根据权利要求2所述的多肽，其中与具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的所述基于支架的分子相比较，[D]_50%从约0.1 M增加到约2.0M，并且与具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的所述基于支架的分子相比较，自由能(ΔG)从0.1千卡/摩尔增加到约10千卡/摩尔。

5.一种包含基于支架的分子的多肽，所述基于支架的分子包含拓扑类似于第三个纤连蛋白结构域的结构域的环结构域，所述多肽具有基于第三个纤连蛋白结构域的共有序列的氨基酸序列，所述第三个纤连蛋白结构域具有选自SEQ ID NO: 142-151的一个氨基酸序列的氨基酸序列。

6.一种包含基于支架的分子的多肽，所述基于支架的分子包含拓扑类似于第三个纤连蛋白结构域的结构域的环结构域，所述多肽具有基于第三个纤连蛋白结构域的共有序列的氨基酸序列，所述第三个纤连蛋白结构域具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 16的特定残基被替换，并且增强所述基于支架的分子的热稳定性和化学稳定性，其中所述基于支架的分子包含选自N46V、E11N、E14P、L17A E86I、G73Y、E37P和E86I的一个或多个取代。

7.一种具有能够接触靶标的环的根据权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述环区域已经修饰为涵盖在氨基酸序列的选自13-16、22-28、38-43、51-54、60-64和75-81的位置处的备选残基，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO: 16和142-151。

8.根据权利要求6所述的蛋白质支架，其中如通过表面等离子体共振或Kinexa方法测定的，所述支架以选自至少10^-9M、至少10^-10M、至少10^-11M以及至少10^-12M、至少10^-13M、至少10^-14M和至少10^-15M的K_D中的至少一种亲和力结合靶标。

9.一种构建基于支架的蛋白质的文库的方法，所述基于支架的蛋白质衍生自FN3结构域的稳定性增强的共有序列，所述FN3结构域掺入随机化密码子以便产生多肽变体，所述方法包括以下步骤：

提供编码衍生自FN3结构域的共有序列的多肽的多核苷酸；和

在所选位置上将随机化密码子引入所述多核苷酸序列内；和

增殖所述多核苷酸的拷贝，以形成编码变体支架蛋白的多核苷酸的文库。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述稳定性增强的共有序列选自SEQ ID NO: 142-151的氨基酸序列。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述随机化密码子选自NNS和NNK。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述随机化密码子在编码至少一个环区域的位置处掺入，所述至少一个环区域选自SEQ ID NO: 142-151的位置13-16、22-28、38-43、51-54、60-64和75-81之处或附近的残基。

13.一种文库，其通过根据权利要求11所述的方法产生。

14.根据权利要求12所述的文库，其中所述文库的多核苷酸可操作地连接至展示蛋白质编码序列，并且引入表达载体内用于展示且作为融合蛋白表达。