[发明专利]新颖的天冬酰胺酶

说明书

技术领域

本发明涉及新颖蛋白及编码所述蛋白的多核苷酸序列。更具体地，本发明涉及具有天冬酰胺酶活性的蛋白和使用这些蛋白的方法。

发明背景

近来，公开了丙烯酰胺在很多经加热食物产品中出现(Tareke et al.Chem.Res.Toxicol.13，517-522(2000))。鉴于丙烯酰胺被认为可能对动物和人致癌，该发现产生了世界范围的关注。进一步的研究揭示，在多种经烘焙、煎炸和烤箱制备的常见食物中可检测到相当含量的丙烯酰胺，并且显示，食物中丙烯酰胺的出现是加热过程的结果。Mottram et al.Nature419：448(2002)已提出了作为Maillard反应的结果从氨基酸和还原糖形成丙烯酰胺的途径。根据该假说，丙烯酰胺可在Maillard反应期间形成。在烘焙和烘烤(roasting)期间，Maillard反应负责颜色、气味和味道。与Maillard相关的反应是氨基酸的Strecker降解，提出了形成丙烯酰胺的途径。当温度超过120℃，可检测到丙烯酰胺的形成，在170℃左右观察到了最高的形成速率。当存在天冬酰胺和葡萄糖时，可观察到最高的丙烯酰胺水平，而谷氨酰胺和天冬氨酸仅导致痕量丙烯酰胺。

EU中针对丙烯酰胺从食物接触的塑料迁移进食物的官方迁移限制被设置为10ppb(每kg 10微克)。虽然对烹饪期间形成的丙烯酰胺尚没设置官方限制，但是很多产品(尤其是谷物类、面包产品和基于马铃薯或玉米的产品)超过该值这一事实导致了人们的关注。

已知若干植物原材料含有大量水平的天冬酰胺。在马铃薯中，天冬酰胺是主要的游离氨基酸(940mg/kg，对应总氨基酸含量的40％)，在小麦面粉中，天冬酰胺以大约167mg/kg的水平存在，对应于总游离氨基酸的14％(Belitz and Grosch in Food Chemistry-Springer New York，1999)。丙烯酰胺主要从天冬酰胺(组合还原糖)形成，这一事实可解释经煎炸、烤箱烹饪或烘烤的植物产品中丙烯酰胺的高水平。因此，就公众健康方面而言，急切需要具有低得多的丙烯酰胺水平，或者优选全无丙烯酰胺的食物产品。

已经提出了多种减少丙烯酰胺含量的解决方案，或者通过改变加工变量，例如，加热步骤的温度或持续时间，或者通过化学方式或酶促方式防止丙烯酰胺形成或者通过除去形成的丙烯酰胺来实现。

在若干专利中请中，已经公开了天冬酰胺酶用于减少天冬酰胺水平以及由此减少形成的丙烯酰胺的量的用途。已从若干种真菌来源产生了用于该目的的合适的天冬酰胺酶，例如，从Aspergillus niger(WO2004/030468中)和Aspergillus oryzae(WO04/032648中)。

虽然所有L-天冬酰胺酶都催化同样的化学转化，但这并不意味着它们适合用于同样的应用。多种不同的应用对酶操作的必要条件提出了不同的要求。可能影响到酶促转化速率的物理和化学参数是温度(对化学反应速率有正面影响，但是可能对酶稳定性有负面影响)、水分含量、pH、盐浓度、食物基质的结构完整性、酶的活化剂或抑制剂的存在、底物和产物的浓度等。因此，人们正需要改进的天冬酰胺酶，其具有改进的性质适于多种应用。

发明详述

本发明涉及展示天冬酰胺酶活性并显示下述比活性的多肽：(i)在37℃的温度下在pH 5和pH 8之间的pH下，是SEQ ID NO：1的A.niger野生型天冬酰胺酶的比活性的至少两倍，和(ii)其在pH 5、pH 6和pH 7下比在这些pH值下的来自WO 2008/128974的变体天冬酰胺酶ASN02(在本专利申请的SEQ ID NO：20中描绘并对应于WO2008/128974中的SEQ IDNO：5)的比活性至少高10％。此类蛋白具有在SEQ ID NO.1的位置63上的天冬氨酸、甘氨酸或组氨酸和在位置88上的丝氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸，SEQ ID NO.1是如在WO 04/030468中公布的A.niger野生型天冬酰胺酶的序列。优选地该多肽与在SEQ ID NO：1中描绘的野生型A.niger天冬酰胺酶具有至少90％、优选地至少95％的同一性程度(％同一性)。