[发明专利]用于改善脂肪酸含量而开发的铜绿假单孢菌菌株及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因的重组铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)及其制备方法，尤其是一种以有关脂肪酸生物合成的基因转基因的脂肪酸过量表达用铜绿假单孢菌及其制备方法。

背景技术

使用化石燃料时大量排放地球暖化气体及废弃物，从而为人类带来了严重的环境危机。因此迫切需要开发能够替代基于化石燃料的化学工业，亦即以尽量减少有害于人类的废弃物的生产及能源消耗的生物物质作为原料的新环保生物工艺。生物乙醇、生物柴油、生物气(biogas)、丁醇作为生物能(Bio energy)而受到人们重视，上述的生物能虽然都能作为发电或运输用燃料使用，但因为它们在实际应用与生产方法上的若干缺点而使得作为新再生能源的烃(hydrocarbon)形态的化合物日益受到关注。因此，能够以代谢产物的方式生成长链脂肪酸(long chain fatty acid)的重组菌株也日益受到人们关注。

铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)是绿脓杆菌，1882年由Gessard在绿色的脓汁发现，由于形成绿色而被称为绿脓杆菌。绿脓杆菌广泛存在于自然界，可以从脓、咳痰、粪便、尿、胆汁、子宫分泌物、血、脊髓液等分离。铜绿假单孢菌绿脓杆菌的形态为革兰阴性杆菌，培养时形成类似于荚膜的细胞外多糖粘质层。形成类似于荚膜的细胞外多糖粘质层。它是一种对自然界具有强大适应能力的微生物。该菌生长所需营养条件非常单纯。化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)能够引起肺炎、咽喉炎、急性肾炎、毒性休克症候群之类的疾病。

脂肪酸(fatty acid)是具有1个羧基(-COOH)的烃链的羧酸，表示链状1价羧酸(Carboxylic acid)。由于水解脂肪时生成而使用该名称。脂肪酸分子由烃链(hydrocarbon chain)构成，烃在碳的基本架构上以侧链链接氢并且在一端附着羧基。在生体内部，脂肪酸可由脂肪酸循环(fatty acid cycle)分解或合成。该循环以2个碳为单位合成或分解脂肪酸，因此存在于自然界的脂肪酸几乎大部分以双数碳数形成。

微生物生体内起自糖的脂肪酸生物合成的第一个步骤从乙酰辅酶A(acetyl-CoA)开始，之后以两个碳原子为单位连接到烃链而拉长链。在细胞质中由乙酰辅酶A羧化而生成作为脂肪酸生物合成中重要中间物的丙二酰-辅酶A(malonyl-CoA)。该反应由乙酰辅酶A羧酶(carboxylase)复合体催化，该复合体由三个酶构成，为了酶活性，不仅需要ATP，还需要Mn²⁺与蛋白生物素(Biotin)。丙二酰-辅酶A的丙二酰基(Group)里的三个碳原子中两个在生物合成反应的每个步骤添加到脂肪酸链。与丙二酰-辅酶A的形成相同地，该反应需要位于细胞质而没有与膜结合的多酶复合体。由个别酶构成的该复合体指的是脂肪酸合成酶。作为该脂肪酸合成酶复合体的一部分，酰基载体蛋白质(acyl carrier protein：ACP)参与到增加脂肪酸(fatty acid)碳数的结合。

在微生物的脂肪酸代谢途径过程中，对脂肪酸生产的过量表达为目的的尝试与努力一直没有间断。与其它生物体相比，人们对大肠杆菌的酶生产系统已经得知了很多代谢信息，有关基因的信息几乎全被发现并且广泛地适用于重组蛋白质的生产。然而，铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)与其它种的基因被共同表达时所造成的影响却没有多少研究。

虽然针对通过引入植物基因而增进脂肪酸进行了很多研究，但是像本发明一样通过引入其它微生物的基因而改善脂肪酸的生产却没有多少研究。

因此，为了增进脂肪酸含量而引入了包含脂肪酸在内的脂质含量极高的绿脓杆菌(pseudomonas)的基因及从草兰氏阳性菌引入不存在于绿脓杆菌(pseudomonas)的基因。

为了开发出能够在铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)的脂肪酸生物合成代谢途径(fatty acid biosynthesis pathway)的初始步骤中增加脂肪酸含量并高效率地生产特定代谢产物的菌株，本发明人凭借对生物代谢网的理解及插入基因的基因操作开发重组菌株而完成了本发明。