[发明专利]用纳米孔的分析物测序

说明书

【相关申请的交叉引用】

本申请要求2010年2月23日提交的美国临时申请系列No.61/307,441，和2010年8月20日提交的美国临时申请系列No.61/375,707的权利，各通过引用以其整体并入本文。

【有关序列表的声明】

与本申请关联的序列表以文本形式代替纸拷贝提供及通过引用并入说明书。含有序列表的文本文件的名称是36172_SEQ_Final_2011-02-23.txt。文本文件是12KB；创建于2011年2月23日；及经EFS-Web随着说明书的提交而提交。

【政府许可证权利的声明】

本发明在由美国健康学会颁发的资金号5R21HG004145和R01H6005115的政府支持下完成。政府在本发明中具有特定权利。

【背景技术】

DNA中编码的信息对医学及生命科学具有至上重要性。人基因组的标位革命化遗传病症理解和疾病的预测，及会辅助发展治疗。快速和不昂贵地测序DNA的能力是个别化的医学及科学研究所必要的。需要超过原Sanger测序的新测序技术的开发来达到这些目标。甚至更优选的是可应用于除了核酸之外的聚合物的新测序技术。

【发明概述】

因此，一些实施方式提供对2个或更多用至少第1阻拦构建体和第2阻拦构建体修饰的分析物单元进行测序的方法，其包括：（a）提供在包含第1导电液体介质和修饰的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔，其中纳米孔包含提供顺式侧和反式侧之间的液体交通的开口；（b）使修饰的分析物的第1阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生第1离子电流水平，其中第1离子电流水平代表第1单元；（c）改变修饰的分析物的第1阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；（d）使修饰的分析物的第2阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生代表第2单元的第2离子电流水平；及（e）将第1离子电流水平和第2离子电流水平与已知的单元的已知的离子电流水平进行比较，由此对2个或更多分析物单元进行测序。

也提供的是对核酸的2个或更多核苷酸进行测序的方法，其包括：（a）提供包含至少2个各定义为Xn的未知的核苷酸或未知的重复核苷酸组的核酸，其中n=1～1,000,000，且其中各X和各n可相同或不同；将第1插入物阻拦构建体和第2插入物阻拦构建体放入核酸，各包含双链核酸和各与Xn相邻，以提供修饰的核酸；（c）提供在包含第1导电液体介质和修饰的核酸的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的突变MspA孔蛋白；（d）使第1插入物阻拦构建体在进入突变MspA孔蛋白的隧道后中止修饰的核酸，由此产生第1离子电流水平，其中第1离子电流水平代表第1Xn；（e）改变第1插入物阻拦构建体，所述改变允许修饰的核酸向反式侧前进；（f）使修饰的核酸的第2插入物阻拦构建体在进入开口后中止，由此产生代表第2Xn的第2离子电流水平；及（g）将第1离子电流水平和第2离子电流水平与已知的Xn的离子电流水平进行比较，由此对核酸的2个或更多核苷酸进行测序。

也提供的是将离子电流水平与已知的分析物单元关联的方法，其包括：（a）提供在包含第1导电液体介质和用2个或更多阻拦构建体修饰且含有全部已知的目标单元的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔，其中纳米孔包含提供顺式侧和反式侧之间的液体交通的开口；（b）使修饰的分析物的第1阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生离子电流水平，其中离子电流水平代表第1已知的分析物单元；（c）改变修饰的分析物的第1阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；（d）使修饰的分析物的第2阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生代表第2单元的第2离子电流水平；及（e）用含有全部单元及对应目标离子电流水平的已知的修饰的分析物校准纳米孔和任选地获得分隔物水平，由此将各离子电流水平与已知的分析物单元关联。

还提供的是减缓或促进修饰的分析物通过纳米孔的开口转位的速度的方法，其包括：（a）提供在包含第1导电液体介质和修饰的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔；（b）使修饰的分析物的阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生一个或更多离子电流水平，其中各离子电流水平是可区分的；及（c）改变至少修饰的分析物的第1阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；其中修饰的分析物具有小于分析物在修饰和改变的缺失下通过隧道转位的平均转位速度的经开口平均转位速度。