[发明专利]分离和纯化核酸的色谱设备和方法

说明书

高品质核酸的分离是现代分子生物学中很多不同技术的前提，例如PCR扩增、印迹分析和基因组文库构建，用于如分子诊断领域。特别是当核酸获自含细胞材料的生物样品时，必须将它们与污染物如蛋白质、脂质和其它细胞成分相分离，否则这些污染物可能干扰下游应用中所使用的限制性酶、连接酶和/或耐热DNA聚合酶。此外，必须去除存在于生物样品中的RNA核酸酶(RNA酶)和特定DNA核酸酶(DNA酶)以避免DNA降解。

已开发了多种不同方法用于从含细胞组分的生物样品中分离基因组DNA。所有这些方法都包括通过破坏细胞膜来使起始材料破裂和裂解并释放其内容物至溶液中的步骤。所获得的溶液称为裂解物。在后续步骤中，从所述裂解物中去除蛋白质尤其是核酸酶以及其他污染物，并最终回收(或多或少)经纯化的DNA(综述可见凯杰公司(QIAGEN)关于“Genomic DNA Purification(基因组DNA纯化)”的手册)。所述DNA纯化步骤至关重要，因为污染物如盐、去污剂、有机溶剂特别是酚和乙醇的残留往往抑制DNA在下游应用中的性能。

用于从细胞裂解物分离基因组DNA的一种非常简单快速的技术是将细胞裂解物在高温如90°C下孵育约20分钟或在额外的蛋白酶消化后直接使用所述裂解物。但是，这些裂解物通常含有酶抑制性污染物如高盐负荷，因而，被视为快速粗糙技术的这些方法仅适用于有限范围的应用。

称作盐析的方法是用于将DNA与细胞裂解物中存在的其它细胞组分相分离的公知技术，其中通过添加含有高浓度盐如乙酸钾或乙酸铵的溶液来从粗提细胞裂解物中沉淀出蛋白质和其它污染物。然后通过离心将所形成的沉淀从含有DNA的溶液中去除，并通过在后续步骤中用醇沉淀来从上清液回收DNA。在这些方法中，蛋白质(尤其是核酸酶)和其它污染物的去除往往很低效，需要额外的RNA酶处理、透析和/或反复醇沉淀来获得足够纯的DNA以用于下游应用，使得这些方法繁复且费时。

将DNA与细胞裂解物中存在的其它化合物相分离的另一可能性是用有机溶剂从裂解物中萃取污染物。在第一步中，通常用去污剂裂解细胞，然后用溶剂如酚、氯仿和异戊醇萃取裂解物以去除污染物。这些方法的一个缺点是所用溶剂的毒性。此外，还需特别留意pH和盐浓度以确保多数污染物被萃取入有机相，而DNA保留在水相。然后通过醇沉淀从水相回收DNA。尽管有机萃取方法非常耗时，用这些方法所分离的DNA通常含有残留的酚和/或氯仿，会在下游应用如PCR中成为抑制剂。此外，所产生有毒废弃物的处置必须遵守公害废料指南(Hazardous waste guideline)。

近年来，开发了基于离子交换，亲和性和/或疏水性相互作用的吸着过程以尽可能降低纯化过程中的DNA降解。这些吸着(sorption)过程中，由于DNA和含树脂或基质的固定固相之间的特异性相互作用而将DNA或多或少地特异性“吸着”，可以是吸附、吸收或化学结合于所述固相，而污染物与固相的相互作用程度不同于DNA，因此可通过如清洗步骤来将污染物和所吸着的DNA分离。一旦去除污染物后，需通过洗脱步骤从固相回收DNA，洗脱步骤通常包括用溶液(流动相)淋洗固相的步骤，所述溶液中包含尽可能降低固相和DNA间相互作用的化合物，从而将DNA从固相移除。然后收集包含DNA(洗脱液)的流动相。这些基于固相的方法使DNA的分离纯化过程能自动化。此外，还能用这些方法可靠地处理相当微量的DNA。

阴离子交换方法是基于核酸的带负电磷酸和阴离子交换载体上的带正电表面分子之间的相互作用(Forcic等，J.Chromatogr.A 2005,1065(1),115-120)。在低盐条件下溶液中存在的DNA选择性结合固定相，而杂质如RNA、细胞蛋白质和代谢物可用中盐缓冲液从固定相洗出。下一步中，DNA可用含有高盐浓度的缓冲液从固相洗脱。然后通过醇沉淀从洗脱液回收经纯化的DNA。

在基于二氧化硅的方法中，核酸在高浓度离液盐存在下选择性吸着于硅胶膜(Hanselle等，Leg Med(东京)2003,5 Supp.1,S145-S149)。RNA、细胞蛋白质和代谢物从膜上洗除，然后用低盐缓冲液将DNA从硅胶膜上洗脱。

本领域也已知基于DNA和作为固定相的磁性颗粒之间的相互作用的固相方法(Prodělalová等，J.Chromatogr.A 2004,1056,43-48)。

尽管吸着方法可分离高品质DNA，这些结合-清洗-洗脱程序中要进行的步骤数量仍相对较高并因而费时。