[发明专利]二硫键稳定的功能性可溶MHC II类异二聚体

说明书

技术领域

本发明涉及二硫键稳定的重组MHC II类分子。

背景技术

主要组织相容性复合体(MHC)分子为脊椎动物免疫系统的主要组成部分，存在于所有有核细胞表面。MHC有两种主要的形式，即MHC I类和MHCII类。重要的是，两种类型都与蛋白质水解加工的肽形成称为T细胞表位的功能性复合体，这发生于表达特定MHC的完全相同的细胞中。产生的肽/MHC(pMHC)复合体随后作为跨膜复合体存在于细胞表面上——该现象称之为抗原递呈。然后细胞表面-结合的pMHC可以与其同源部分(cognate partner)——T细胞受体(TCR)相互作用，所述T细胞受体存在于T淋巴细胞的表面。

鉴于其在适应性免疫中的重要作用，基础和应用科学对在细胞和分子水平上理解pMHC-TCR的相互作用很感兴趣，从而获得两种分子的重组类型。也日益认识到，能否获得这种重组分子对能研究和理解系统生物，以及对开发新的治疗和诊断是非常关键的。

许多重大的医学疾病需要进行治疗干预(therapeutic interventions)，以调节病人免疫系统的活动。在如自身免疫性疾病和过敏症中，需要抑制过于活跃的免疫系统和慢性炎症。相反，免疫刺激是与感染和癌症有关的途径，以将免疫细胞激活并靶向于癌细胞。此外，移植接受者通常需要免疫抑制。同时，这也导致了大量免疫调节剂的产生，目前是一个数十亿美元的产业。

理解这些疾病中的免疫成分和筛选新的治疗方法的关键是抗原递呈细胞和T细胞间的相互作用，或者更具体地是MHC I型和II型分子与TCR间的相互作用。II型MHC特异性的与外源衍生肽结合，并将它们递呈给CD4+T辅助细胞(TH细胞)。然后所述TH细胞被活化并成为分泌各种细胞因子的效应细胞。这些细胞因子大量地活化参与处理威胁的其它免疫细胞。该系统的故障会导致诸如自身免疫性疾病或者使癌细胞生存和分裂。因此，自身免疫性疾病的特征是与MHC密切相关和靶器官T细胞浸润(infiltration)。

用于免疫调节剂筛选的平台需要稳定的、完全功能性的可溶性MHCII类分子。重要的是，目前可溶MHC II类分子的制备由于严重的问题而受阻，即缺乏分子稳定性。

在过去的几年里，制备四聚体的可溶MHC I类分子的能力(四聚体技术)已经使基础和应用免疫学发生了变革(Constantin et al.，2002，Biological Research for Nursing，4：115-127)。原因是，无论是就抗原而言还是就T细胞反应而言，四聚体技术已大幅提高了以特定方式追踪免疫反应过程的能力，这主要通过流式细胞术来评估。这种能力也带来了对免疫系统更深入的了解且确实可能带来了新的诊断工具。

到目前为止，四聚体试剂在很大程度上限于MHC I类分子，因为关于重组MHC I类制备的大多数技术问题似乎已经得到解决。事实上，就MHC II类分子而言，已经证明了这个任务更具显著的挑战性。因此，目前MHC II类四聚体制备的常规方法没有可用的，虽然在文献和商用试剂中都出现了独立的例子(Vollers，S.and Stern，L.，2008，Immunology 123：305-313)。在MHC II类四聚体可获得的少量实例中，它们被广泛地使用，并已对了解疾病的发展产生了巨大的影响。因此，鉴于成功制备重组MHC I类产物已经显示的影响，可以看出无论在学术上还是商业上都存在强烈而清晰的动力，以在新的MHC II类生产道路中投入更多的努力。然而，鉴于迄今为止遇到的问题，成功是不确定的。

由于部分不明的原因，已经证明了MHC II类分子制备成可溶形式的稳定重组分子尤其困难。天然分子是非共价的跨膜异质二聚体，包括α-和β-链，α-链和β-链都具有跨膜区且属于免疫球蛋白(Ig)超家族。各链的细胞外部分包括由两个结构域组成，每个结构域由大约90个氨基酸残基组成，其中两个膜远端结构域，α1和β1结构域形成对T细胞表位的肽结合性能所必需的格状的α/β结构(inter-latticed α/βstructure)。两个膜近端结构域，α2和β2结构域，均形成离散的Ig结构域。在α链和β链中，均有约20个氨基酸残基的一段跨越细胞膜且在膜的细胞质侧存在相当短的肽段。

α链和β链的二聚作用被认为是由以下原因产生(i)跨膜片段，(ii)肽结合以及(iii)在膜中发现的推定的附属成分。因此，一旦脱离其天然环境并作为可溶性分子制备，MHC II类分子经常受到内在低稳定性和非常低的生产水平的制约。此外，必须进行广泛的和资源高要求情况依赖性的优化。