[发明专利]使用HPPD抑制剂作为选择剂的大豆转化

说明书

本发明通常涉及植物转化的方法，并且更具体涉及使用HPPD抑制剂作为选择剂转化大豆器官性细胞或组织的方法。发明也涉及从所述转化大豆器官性细胞或组织中再生转基因大豆植物以及从所述方法得到转基因大豆植物和种子的方法。

大豆（黄豆）是世界上最重要的农作物之一，为食物和饲料应用提供油和蛋白质。它在美国是第二重要的农作物，并且在巴西，阿根廷，中国和印度也大量生产。大豆油是地球上最丰富的植物油，并且油提取后剩余的高蛋白粉是一种非常重要的家畜蛋白补充物。

大豆是已被转基因的农作物之一，并且转基因大豆已应用于更多的产品。1997年，美国为商业市场种植的所有大豆中约8%是转基因大豆。在2009年，所述数字是95%。

尽管转基因大豆需求增多，大豆仍然是难以转化的植物和难以植物再生的物质。仍然需要改进和创新来获得可靠和有效的转化和再生过程。

转化植物细胞的方法一般包括下列步骤：

a）制备能接受异源基因的植物细胞，

b）用异源基因转化感受态细胞，

c）培养和选择含有异源基因的转化细胞。

转基因植物的生产包括整合异源基因到其基因组，然后在于执行下列步骤：

d）从转化细胞中再生植株和，

e）适当情况下，生产和回收可育转化植物的种子。

一般，和更具体对于如大豆这种难于转化的植物，选择转化细胞的合适和有效方法可行性非常重要。另外，选择标记一般在转化植物中出现，除非随后和通常应用繁复方法将其去除，并且某些选择标记类型如抗生素抗性基因可能不需要。

大豆转化中目前使用两个主要方法。第一个方法有利地对胚性愈合组织、固体上或悬浮液中的细胞培养物、或其他增殖胚性组织使用粒子轰击（Trick和iner，1998；Maughan等，1999；Santarem和Finer，1999；Droste等，2002），而第二种方法涉及器官性组织的农杆菌属（Agrobacterium）介导转化，例如子叶节组织（Zhang等，1999；Clemente等，2000；Olhoft和Somers，2001；Olhoft等，2001）或衍生自成熟大豆种子的组织（美国7,473,822；EP10356036.3）。

McCabe等（1988）使用基因枪介导的转化和gusA基因作为报道基因来生产大豆植物，而不选择抗性标记。通过评价再生新芽和植物的GUS表达来跟踪转化组织。尽管这种方法用于生产草甘膦除草剂抗性系RR1，其被育种者用于生产在一半以上全美国大豆面积上生长的商业抗农达（Roundup）品种，这是非常劳动和资本密集型方法，在回收转化株数目上效率低下（Padgette等，1995）。

后来，开发出使用抗性试剂选择的更有效基因枪介导方法。

1991年，Finer和McMullen成功使用包被有潮霉素抗性和β-葡糖醛酸酶（GUS）编码质粒DNA的粒子轰击大豆的胚性悬浮培养组织。

1997年，通过微粒轰击来转化胚轴外植体，使用bar基因作为选择标记基因并选择草胺磷（US 5,968,830）。

2000年，羟基苯基丙酮酸双氧化酶（HPPD）基因已经成功并第一次用作基因枪介导的增殖胚性组织转化的选择标记基因，所述组织通过在合适诱导培养基上培养大豆未成熟合子胚而得到（US 6,768,044）。HPPD抑制剂通过抑制质体醌和类叶红素的合成来作用于植物细胞。这种作用产生对所述细胞生长无害的胚性组织的白化。只有包括HPPD抑制剂耐受基因的转化植物细胞保持绿色并且能加以选择，因为它们不同于未转化细胞。通常，选择试剂在转化后引入细胞培养基。使用HPPD基因作为基因枪介导转化增殖胚性组织的选择标记基因的情况下，作者能通过在转化步骤前引入HPPD抑制剂到感受态植物细胞培养基来选自转化细胞，从而白化所述细胞。然后白化的感受态细胞用作为选择标记的HPPD抑制剂耐受基因转化，并且已经整合所述选择标记到其基因组的转化细胞变成绿色，使其可以被选择（US 6,768,044）。

这些最新方法有效提高基因枪介导的大豆转化。然而，通过粒子轰击转化增殖胚性组织有几个缺点：需要延长的组织培养期，经常在植物基因组中产生复杂的转基因插入模式，和可能引起不育植物的再生（Liu等，1996；Singh等，1998；Reddy等，2003）。

相反，农杆菌介导转化器官性组织可以在转化前降低广泛的组织培养过程，并且造成简单插入模式的整合（一般小于3个拷贝，且常常是单一插入），其消除拷贝之间后续重排的风险。