[发明专利]用于纯化含FC的蛋白的色谱方法

说明书

本发明涉及纯化蛋白的色谱方法和用于所述方法的试剂。

生物分子(例如蛋白、多核苷酸、多糖等)作为药物、诊断试剂、食品添加剂、去污剂、研究试剂和很多其他应用方面的商业价值越来越重要。所述生物分子(例如蛋白)的需求已不能一般地通过从天然来源物质分离分子得以满足，而是需要使用生物技术生产方法。

蛋白的生物技术制备通常开始于分离编码所需蛋白的DNA及其克隆至合适的表达载体中。将所述表达载体转染至合适的原核或真核表达细胞并且随后选择所转染的细胞之后，在发酵器中培养所转染的细胞，使所需蛋白得以表达。然后收集该细胞或培养上清液，后处理并纯化其中所含的蛋白。

在真核表达系统的情况下，即当使用哺乳动物细胞(例如CHO或NSO细胞)培养时，例如，在过去15年里，在表达步骤中可以获得的细胞培养或细胞培养上清液中的所需蛋白的浓度提高了100倍。而在同一时期，在后续的蛋白纯化步骤中所使用的色谱材料的结合能力仅提高了3倍。基于此原因，亟需改进、优化生物分子(特别是蛋白)的纯化方法，使之能够在工业规模下进行。

在生物制药方面，例如将蛋白用作药物(例如治疗性抗体)，除了产品的产率之外，杂质的分离也十分关键。可将杂质分为方法依赖的和产物依赖的杂质。方法依赖的杂质含有宿主细胞的成分，例如蛋白(宿主细胞蛋白，HCP)和核酸，其来自细胞培养(例如培养基成分)或后处理(例如盐或溶解的色谱配体)。产物依赖的杂质为所述产物的具有不同性质的分子变异体，包括简化形式(例如前体和水解分解产物)以及修饰形式(例如通过脱氨化、错误糖基化或二硫桥的错误连接而形成)。所述产物依赖的分子变异体还包括聚合物和聚集物。其他杂质为污染物，是指不直接属于生产方法的所有其他化学、生化或微生物来源的物质。污染物例如为在细胞培养中不希望得到的病毒。

在生物制药之中，杂质会导致安全方面的担忧。如果治疗性蛋白通过注射或输注直接进入血液(这是生物制药中经常出现的情况)，那么这种担忧将更强烈。因此，宿主细胞成分可导致变态反应或免疫病理学作用。此外，杂质还可导致所给药的蛋白出现不希望的免疫原性，即其可能使患者对该治疗剂产生不希望的免疫应答，甚至可能产生危及生命的过敏性休克。因此，需要合适的纯化方法，以便通过该方法使不希望的物质降低至不显著的水平。

另一方面，生物制药中也不可忽视经济方面。因此，所使用的生产和纯化方法不应危害由此制备的生物制药产品的经济价值。此外，建立新的纯化方法的时间量度也很重要：除了对成本的影响之外，方法的开发需要与药物的临床前和临床研究相一致。因此，例如，一些临床前试验和所有临床试验只有在生物药物具有足够的纯度和足够的量之时才能开始。

以下标准方法由四个基本步骤组成，其可能作为研发能够在工业规模进行的抗体纯化方法的起点：第一步中分离靶蛋白、浓缩并稳定化(″捕获)。第二步中将病毒除去，第三步中进行纯化，将主要的杂质(例如核酸、其他蛋白和内毒素)除去。最后一步除去任何痕量的污染物(精处理(polising))。

除了过滤和沉淀步骤，(柱)色谱方法也很重要。因此，捕获常常通过包括亲和性色谱纯化的步骤。据此，其中可使用很多已知的柱色谱方法和色谱材料。

亲和性色谱基质，下文也称为亲和性基质，在多种物质的工业纯化中用作固定相。通过固定配体的手段，可能特异地富集和纯化对所用具体配体具有一定亲和性的物质。对于抗体(免疫球蛋白)的工业纯化，特别是单克隆抗体的纯化，已证实将固定化A蛋白用作初始纯化步骤是有效的。A蛋白为金黄色葡萄球菌的约41kDA的蛋白，其以高亲和性(对于人IgG为10^-8M-10^-12M)结合至免疫球蛋白的Fc区的CH₂/CH₃域。在A蛋白色谱中，来自流动相的具有A蛋白结合Fc区的免疫球蛋白或融合蛋白特异地结合至A蛋白配体(其共价结合至载体(例如琼脂糖凝胶))。来自金黄色葡萄球菌的A蛋白(野生型A蛋白)和遗传学修饰的重组A(rec.A蛋白)蛋白通过非共价作用与抗体的恒定区(Fc片段)相互作用。这种特异性相互作用可用于有效地从抗体中分离杂质。通过改变pH可特意停止抗体和A蛋白配体之间的相互作用，且该抗体可从固定相得以释放或洗脱。