[发明专利]一种利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法。

背景技术

油菜是我国四大油料作物之一，其产量位居世界首位，油菜因其适应性强、用途广、经济价值高被广泛种植。我国栽培的油菜按其形态学、细胞学及生物学特性，分为白菜型油菜(Brassica rapa，n＝10)、芥菜型油菜(Brassica juncea，n＝18)和甘蓝型油菜(Brassica napus，n＝19)三大类型。甘蓝型油菜由于其产量高、抗性强等一系列优良特性，自引入我国后被大力推广，种植面积迅速扩增。菜籽油是我国重要的食用油来源，约占全国食用油种植面积的50％。随着我国经济的发展，油菜生产越来越受到社会各界的关注。目前，我国油菜常规育种工作者主要从事双低油菜(低芥酸和低硫甙)育种和抗性育种等方面的研究。在常规油菜品种选育过程中，要育成一个稳定的自交系，至少需要5年。然而，通过油菜小孢子胚胎再生技术，易于进行早期选择，可以在较短的时间里获得纯合的育种材料，显著缩短了育种年限，利用小孢子培养途径比传统选育途径具有明显的优势。因此，在前人研究的基础上，将小孢子胚胎发生途径与现代生物技术结合，对创建新的油菜种植资源具有重要的意义。通过小孢子培养快速、有效地获得的纯系，可直接用于培育新品种或作为优良亲本间接应用于品种改良。因此，建立高效的油菜小孢子转化体系具有重要的应用价值，是植物基因工程的一个新研究方向。自Licther等(1982)首次报道甘蓝型油菜小孢子培养并获得再生植株以来，许多研究者对影响油菜小孢子胚状体再生频率的诸多因素进行了研究，包括培养基组成和培养条件、供体植株基因型及其生长条件、小孢子发育时期等。

发明内容

本发明提供了一种利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法，采用高出胚率的油菜品种作为供体植株，以PEG代替或者部分代替蔗糖作为渗透调节剂，该方法小孢子出胚率高，小孢子胚状体植株再生率高，加倍率高。

一种利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法，包括以下步骤：

(1)取甘蓝型油菜的花序作为小孢子培养的供体植株；

(2)从所述供体植株上取花蕾并灭菌，再将灭菌后的花蕾加入到NLN-13液体培养基中，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀，在所述沉淀中依次加入含PEG6000的NLN液体培养基、秋水仙碱溶液和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液；

所述的NLN-13液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，蔗糖130g，pH 5.6～6.2；所述含PEG6000的NLN液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L和蔗糖1～65g，PEG6000 62.5～250g，pH 5.6～6.2；所述秋水仙碱溶液的质量百分浓度为0.3～0.8％；所述活性炭混合液，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，琼脂糖2～5g和活性炭8～15g；

(3)将所述小孢子混合悬浮液在黑暗条件下于30～33℃恒温热激处理0～3天，后取出在黑暗条件下于22～28℃培养10～15天，直至肉眼可见时，在黑暗条件下于22～28℃摇动培养5～10天，得到子叶期胚状体；

(4)将所述子叶期胚状体接种至分化培养基中，在每天12～18小时光照和22～28℃下培养，形成再生芽；其中，所述分化培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，脱落酸(ABA)2～4mg，萘乙酸(NAA)0.2～0.5mg，蔗糖25g，琼脂6.5～7.5g，pH5.6～6.0；

(5)切取再生芽接种至生根培养基上，在每天12～18小时光照和22～28℃条件下进行生根培养，将根生长健壮的苗经炼苗和移栽到土壤中，得到再生植株，鉴定倍性；其中，所述生根培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，萘乙酸(NAA)0.5～1mg，蔗糖25g，琼脂6.5～7.5g，pH5.6～6.0。

本发明中：