[发明专利]一种利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法

权利要求书

1.一种利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取甘蓝型油菜的花序作为小孢子培养的供体植株；

(2)从所述供体植株上取花蕾并灭菌，再将灭菌后的花蕾加入到NLN-13液体培养基中，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀，在所述沉淀中依次加入含PEG6000的NLN液体培养基、秋水仙碱溶液和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液；

所述的NLN-13液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，蔗糖130g，pH 5.6～6.2；所述含PEG6000的NLN液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L、蔗糖1～65g和62.5～250g PEG6000，pH 5.6～6.2；所述秋水仙碱溶液的质量百分浓度为0.3～0.8％；所述活性炭混合液，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，琼脂糖2～5g和活性炭8～15g；

(3)将所述小孢子混合悬浮液在黑暗条件下于30～33℃恒温热激处理0～3天，后取出在黑暗条件下于22～28℃培养10～15天，直至肉眼可见时，在黑暗条件下于22～28℃摇动培养5～10天，得到子叶期胚状体；

(4)将所述子叶期胚状体接种至分化培养基中，在每天12～18小时光照和22～28℃下培养，形成再生芽；其中，所述分化培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，脱落酸2～4mg，萘乙酸0.2～0.5mg，蔗糖25g，琼脂6.5～7.5g，pH5.6～6.0；

(5)切取再生芽接种至生根培养基上，在每天12～18小时光照和22～28℃条件下进行生根培养，将根生长健壮的苗经炼苗和移栽到土壤中，得到再生植株，鉴定倍性；其中，所述生根培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，萘乙酸0.5～1mg，蔗糖25g，琼脂6.5～7.5g，pH5.6～6.0。

2.如权利要求1所述的利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法，其特征在于，所述的花蕾为花序上花瓣和花药长度比为0.5～0.7、单核晚期至双核早期的花蕾。

3.如权利要求1所述的利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法，其特征在于，所述步骤(2)为：从所述供体植株上取花蕾并灭菌，再将灭菌后的花蕾加入到NLN-13液体培养基中研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀后；在沉淀中再次加入NLN-13液体培养基研磨成悬浮液，再次过滤所得滤液经离心、弃上清液，再次得到沉淀；在所述沉淀中依次加入含PEG6000的NLN液体培养基、秋水仙碱溶液和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液。

4.如权利要求1或3所述的利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的过滤采用44μm无菌滤网。

5.如权利要求1或3所述的利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的离心的条件为：900～1200rpm离心3～5min。

6.如权利要求1所述的利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法，其特征在于，步骤(3)中，在黑暗条件下培养温度为25±2℃。

7.如权利要求1所述的利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法，其特征在于，步骤(3)中所述子叶期胚状体在3℃～8℃保存。

8.如权利要求1所述的利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法，其特征在于，步骤(4)中，培养条件为每天16小时光照和25℃下培养，培养时间为20～30天。

9.如权利要求1所述的利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法，其特征在于，步骤(5)中，培养条件为每天16小时光照和25℃下培养，培养时间为25～30天。