[发明专利]一种DNA分子及重组质粒和大肠杆菌

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种DNA分子及重组质粒和大肠杆菌。

背景技术

L-苏氨酸是人体所必需的8种氨基酸之一，广泛应用于医药、食品、饲料等，目前L-苏氨酸主要以微生物发酵的方法生产，多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等。由于大肠杆菌发酵生产L-苏氨酸具有繁殖迅速、发酵温度高、生理生化基础研究较深入的优势，逐渐成为L-苏氨酸生产的常用菌株。

随着世界对L-苏氨酸需求量的不断增加，L-苏氨酸高产菌株的研究越来越受到重视。其中，影响大肠杆菌高产的最关键的一个因素就是其耐受L-苏氨酸的能力，只有解除L-苏氨酸对代谢途径的抑制，才能进而增加L-苏氨酸的产量。虽然野生型的大肠杆菌具有表达L-苏氨酸耐受蛋白的基因，但该基因所表达的蛋白量较低，仅为大肠杆菌正常生长所需，并不能耐受大于0.1M浓度的L-苏氨酸，使得野生型的大肠杆菌的产酸能力较低。

因此，利用生物技术手段对野生型大肠杆菌进行改造，使其能够具有较高L-苏氨酸耐受能力，对L-苏氨酸的生产具有十分重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种DNA分子及重组质粒和大肠杆菌，使得所述大肠杆菌对L-苏氨酸具有较高的耐受活性。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明从NCBI数据库获得来自于耶尔森氏菌属-Yersinia enterocolitica W22703的一段蛋白质序列，其氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示，NCBI蛋白序号为Gi：3308625798，该蛋白具体功能尚未得到公开确认，而经申请人研究其具有耐受L-苏氨酸的活性，但是表达该蛋白的基因来源于同大肠杆菌种属差异较大的耶尔森氏菌属，其在大肠杆菌中并不能正确表达该蛋白。故本发明按照大肠杆菌W3110密码子的偏好性，优化密码子，通过核酸合成仪合成核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子，测序验证该序列的正确性，合成基因酶切位点为SmaI/HindIII，其中优化、合成工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

本发明还提供一种重组质粒pKR-C，由质粒pKK223-3在其SmaI和HindIII酶切位点间插入如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA分子获得，经PCR和酶切验证并测序，表明如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA分子已成功构建至质粒pKK223-3中SmaI和HindIII酶切位点间，其质粒图谱见图1。

本发明还提供一种重组质粒pKTR-C，其由以下方法制备：

以重组质粒pKR-C为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的下游引物扩增，BamHI/SphI双酶切扩增产物，获得由Tac启动子、SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA分子、rrnB T1 Terminator终止子、rrnB Terminator终止子组成的片段，然后与经过BamHI/SphI双酶切的质粒pKK223-3-ThrA’BC连接即得；

其中，所述Tac启动子、rrnB T1 Terminator终止子位于片段两端，SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA分子位于Tac启动子、rrnB Terminator终止子之间，rrnB Terminator终止子位于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA分子和rrnB T1 Terminator终止子之间。

经PCR和酶切验证并测序，表明所述片段已成功构建至质粒pKK223-3-ThrA’BC中BamHI和SphI酶切位点间，其质粒图谱见图2。

质粒pKK223-3和pKK223-3-ThrA’BC已在文献“Kwang Ho Lee，Molecμlar Systems Biology 3：149，2007”中公开，并可通过市售获得，两者皆为强表达质粒，以两者为基础质粒构建的重组质粒pKR-C和pKTR-C有助于本发明所述DNA分子在大肠杆菌中的表达。其中，pKR-C带有基础质粒pKK223-3的Tac强启动子，能增加大肠杆菌中所述DNA分子的拷贝数和表达量，并通过基础质粒pKK223-3原有的具有强终止结构的rrnB T1 Terminator终止子和rrnB Terminator终止子终止该基因的表达，以防所述DNA分子中TAG终止密码子不能终止基因表达造成的通读。