[发明专利]SecB介导的翻译后靶向途径的功能构建及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及到嵌合SecA和基于嵌合SecA，由SecB介导的翻译后靶向途径的构建这一技术方法，以及该技术方法在工业上生产分泌蛋白中的应用。

背景技术

细菌被广泛地用来大规模发酵生产具有各种应用价值的蛋白，如：药用蛋白，工业用酶等。目前，按照发酵结束后目标蛋白是位于细胞质内还是培养基中，可以把生产技术分为两类：a)以胞内蛋白的方式生产目标蛋白；b)以胞外蛋白(即分泌蛋白)的方式生产目标蛋白。与前者相比，后者由于目标蛋白位于培养基中，发酵结束后无须回收细胞，无须采取物理，化学或生物的方法将细胞裂解以便目标蛋白的释放，因此大大简化了发酵后目标蛋白的分离纯化工作，有效控制了生产成本[1]。此外，以胞外蛋白的方式生产目标蛋白还具有其他的优势，例如：能够有效减少细胞质内目标蛋白的积累，从而避免包含体的形成[2]；允许含有二硫键的蛋白能够在氧化性环境下进行正确的折叠等。因此，在工业上以分泌蛋白的方式大规模发酵生产目标蛋白是首选方案。

细菌能够将含有信号肽的蛋白(即分泌蛋白)从其翻译地点即细胞质中运输到细胞外培养基中，这一过程称为蛋白质分泌。在细菌中，这一功能的执行主要依赖Sec转位酶(Sec translocase)来实现，其核心由跨膜蛋白通道SecYEG与分子马达SecA(ATP酶)构成[3]，如图5所示。携带信号肽的新生肽链需要从细胞质中被转移到Sec转位酶的关键组分SecA上，这一过程称为靶向；随后，在水解ATP提供能量的情况下，SecA将待分泌的新生肽链经由SecYEG蛋白通道挤压出细胞质，从而进入细胞膜外空间[4]。到目前为止，如图5所示，在细菌中已经鉴定的介导靶向过程的途径有：1)信号肽识别颗粒(SRP)及其受体(SR)介导的共翻译靶向途径，负责新生信号肽疏水性强的分泌蛋白的靶向，即SRP识别暴露于核糖体表面的信号肽，在翻译的同时通过SRP与其受体SR的相互作用，将翻译中的肽链转移到Sec转位酶上[5]；2)SecA介导的共翻译/翻译后靶向途径，负责信号肽疏水性一般的分泌蛋白的靶向，即SecA不需要借助其他因子直接识别新生信号肽[6]；3)SecB介导的翻译后靶向途径，协助SecA识别那些信号肽效率(即新生分泌肽链被分泌系统识别，结合并运输到细胞膜外侧的效率，影响因素包括信号肽特性以及信号肽下游肽段特性)低下的分泌蛋白的靶向，即新生分泌肽链在翻译末期或结束后与SecB结合从而维持非折叠构像，此二元复合物进而依赖SecB与Sec转位酶关键组分SecA的高亲和性(由SecB四聚体表面的“带负电荷的区域”与SecA二聚体羧基末端“带正电荷的锌结构域”即“锌结合基序”之间的相互作用介导)，从而将肽链转移给SecA，完成靶向过程[7，8]。对于特定的分泌蛋白来说，依赖何种靶向途径取决于其信号肽的特性，例如：信号肽疏水性[9，10]。

枯草芽胞杆菌及其亲缘的芽胞杆菌以其强大的蛋白分泌能力而著称，能够将蛋白直接分泌到培养基中使之达到克每升的水平[11，12]。这一特性对于工业用酶生产非常有利，因此这类细菌被广泛用于在工业上生产相关产品[13，14]，例如：在现有的商品化酶中，大约有60％是由属于革兰氏阳性细菌的芽胞杆菌发酵生产的，其中绝大部分是天然分泌的自身蛋白，如：淀粉酶和蛋白酶[2]。虽然用枯草芽胞杆菌生产外源分泌蛋白不乏成功实例，然而与内源分泌蛋白相比，多数情况下枯草芽胞杆菌分泌外源蛋白的效率仍然低下，尤其是那些真核生物来源的蛋白，从这层意义上来说，这限制了其在工业中的广泛应用[15，16]。研究表明，限制外源蛋白分泌效率的因素主要是靶向效率和蛋白酶降解，鉴于此，研究人员发展了各种策略以增强枯草芽胞杆菌对外源蛋白的分泌能力，例如：优化信号肽，过表达靶向因子(SRP)，过表达Sec转位酶组分，过表达伴侣分子以及使用蛋白酶缺陷的菌株等，并且这些策略也被申请了相应的专利[1]。