[发明专利]一种酯酶及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种酯酶及其制备方法和应用。

背景技术

数量巨大的不可培养的微生物中蕴藏着丰富的资源优势，宏基因组的研究为挖掘这一资源优势提供了可靠的技术保障。95％的海洋微生物在现有的实验条件下无法或很难实现人工培养，直接从环境中提取DNA，建立理论上可以覆盖环境中所有微生物的遗传信息宏基因组文库。在海洋深度100米以上的极端环境中获得的基因片段，将这些基因异源表达，有可能得到具有应用价值的新基因。通过构建海洋底泥宏基因组文库，保存海洋微生物的基因多样性，以利于不同类型新型基因的研究与开发利用。

脂肪酶和酯酶是重要的工业酶制剂品种，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的酯酶和脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶和酯酶的规模化生产对于酶催化合成多种化学品有重要意义。

本发明拟从海洋底泥宏基因组文库中筛选抗逆性强，性质优良的新型酯酶和脂肪酶基因，为酶法催化生产化工产品提供备选资源。

发明人在前期的工作中，成功构建了我国南海0～100米深底泥宏基因组文库，该库容DNA达194MB，经酶切、连接和转化，共获得118,000个含有外源基因片段的重组子，其外源片段长度在1.0-8.0Kb之间。建立了酯酶的筛选模型。通过功能筛选获得一个具有酯解活性的插入片段。该片段全长3,482bp，GenBank注册号为GQ168545.1。经ORF Finder预测，该片段有2段完整的ORF序列。其中，编码酯酶或脂肪酶基因的est_p6位于插入片段的2,028～3,101bp。该基因全长1,074bp，编码357aa。其在GenBank的注册号为ACZ16565.1。将该序列在GenBank中进行同源搜索，发现与之相似性最高的蛋白是来源于未培养的海洋细菌的脂解酶(其在GenBank的注册号为ADA70028.2)，相似性为73％。结构预测结果显示，Est_p6具有完整的α/β水解折叠保守结构域(PRK10162)，该结构域包含了丝氨酸、谷氨酸和组氨酸组成的催化三联体，构成酯酶/脂肪酶的催化中心，归属于酯酶/脂肪酶超级家族(cl12031)。综上所述，Est_p6应为酯酶/脂肪酶超级家族(cl12031)一名新成员。

SignalP分析，Est_p6的1^st到26^th氨基酸是N端信号肽，26^th和27^th之间为切割位点(AVA²⁶-Q²⁷E)。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型酯酶。

本发明的另一目的是提供该酯酶的制备方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供的一种酯酶Est_p6^-，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

编码上述酯酶的基因，优选为est_p6^-，所述est_p6^-基因是去掉了N端的前78个编码信号肽的碱基的est_p6基因，所述est_p6基因在GenBank中的登录号为ACZ16565.1。

制备上述基因的载体，优选为pET28a-est_p6^-，该载体含有est_p6^-基因。

上述表达载体pET28a-est_p6^-，由下述方法构建而得：

(1)以宏基因组文库中含有est_p6基因插入片段的质粒为模板，PCR扩增出去掉信号肽的酯酶基因est_p6^-；

(2)将步骤(1)的扩增产物经测序验证后，与pET28a载体重组，得到重组大肠杆菌表达载体pET28a-est_p6^-。

步骤(1)中的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No：2所示。