[发明专利]信号放大型免疫荧光探针及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫快速分析技术领域，尤其涉及一种信号放大型免疫荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

免疫检测技术是目前医学、生物学、食品安全等领域最基本也是最常用的检测技术之一。它广泛应用于医学生物学研究、医学临床、环境检测，以及食品和微生物污染的检测中。免疫检测技术是基于抗体抗原反应的原理对待测物进行定量定性分析的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、简便等优点，是现代生命科学的重要研究手段，在生物分析检测领域有着广泛的应用前景。

荧光免疫测定是指将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术(荧光标记物对抗体或者抗原进行标记)结合起来，并通过荧光信号进行检测的方法。最终目的是通过将抗体与抗原的特异性反应和荧光信号相结合，达到定量检测的目的。

斑点荧光免疫渗透试验，在斑点金免疫渗透试验的基础上发展起来的，后发展为斑点荧光免疫渗透试验，而斑点荧光免疫渗透试验则是用荧光性物质代替了胶体金作为标记物，采用免疫渗透技术、荧光标记物和固相载体相结合的一种检测方法。

荧光免疫层析是在胶体金免疫层析的基础上发展起来的，是以NC膜为载体，利用微孔膜的毛细管作用，使滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，如同层析一般。

目前，FITC、罗丹明、量子点、荧光微球等荧光标记物已经广泛应用于荧光免疫分析技术中。荧光免疫检测方法具有高特异性、敏感性高、速度快的特点。但是该检测方法在应对非常微量的物质时，也存在信号低，噪声干扰大，传统方法难以检出等问题。因此，发展新的免疫检测方法，提高检测的灵敏度是目前分析检测领域发展的迫切要求。

发明内容

本发明提供了信号放大型免疫荧光探针的制备方法，将荧光标记物标记在连接有多羧基大分子和聚赖氨酸或者连接有生物素-链霉亲和素和聚赖氨酸的抗体复合物上，使免疫反应的荧光信号大大放大，提高了荧光免疫检测的灵敏度。

一种信号放大型免疫荧光探针的制备方法，包括：

(1)在缩合剂的存在下，将对苯二胺和均苯三甲酸加入有机溶剂中，于80-100℃缩合反应3-5h，得到多羧基大分子；

(2)将步骤(1)得到的多羧基大分子加入含有1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中进行活化，然后加入抗体，反应0.5-2h；再加入聚赖氨酸，继续反应0.5-2h，得到表面连接有抗体和聚赖氨酸的多羧基大分子；

(3)用荧光标记物对步骤(2)制得的表面连接有抗体和聚赖氨酸的多羧基大分子进行标记，制得信号放大型免疫荧光探针。

步骤(1)中，所述的缩合剂可以为三苯基亚磷酸盐(TPP)与吡啶(Py)的混合物；所述的有机溶剂可以为N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。

所述对苯二胺与均苯三甲酸的摩尔比优选为1∶0.8-1∶1.2；更优选为1∶1。对苯二胺和均苯三甲酸作为反应单体，在缩合剂的存在下能缩合得到多羧基大分子。

优选地，每80-100ml N-甲基-2-吡咯烷酮中，所述对苯二胺的加入量为10mmol，均苯三甲酸的加入量为10mmol，三苯基亚磷酸盐的加入量为20-30mmol，吡啶的加入量为5-15ml。

所述的缩合反应过程中对溶液进行搅拌，确保混合物互溶成均相。

所述的缩合反应完成后，对反应产物进行后处理得到多羧基大分子；所述的后处理可以为：将缩合反应3-5h后的反应产物加入含有盐酸的甲醇溶液中终止反应，分离得到缩合物沉淀，再对缩合物沉淀依次进行重结晶、洗涤和干燥处理。

其中，所述含有盐酸的甲醇溶液中盐酸的浓度为10-15mol/L；所述重结晶所用的试剂为N-甲基-2-吡咯烷酮/甲醇混合液；所述洗涤所用的试剂为热的甲醇；所述的干燥处理为：将缩合物沉淀置于80-120℃烘箱中干燥10-15h。

步骤(2)中，所述含有1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺(EDAC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的溶液的溶剂可以为磷酸盐缓冲液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)的混合液。

所述的抗体可以为单抗或多抗。

所述步骤(1)得到的多羧基大分子、抗体和聚赖氨酸的摩尔比优选为1∶2∶20-1∶3∶50。

所述的活化时间优选为10-15min。

步骤(3)中，所述的荧光标记物可以为FITC、罗丹明、量子点或荧光微球。

本发明还提供了另一种信号放大型免疫荧光探针的制备方法，包括：