[发明专利]一种牛膝组培苗的获得方法

说明书

技术领域

本发明属于中药材栽培技术领域，具体地涉及一种牛膝组培苗的获得方法。

背景技术

牛膝为苋科牛膝属的植物，多年生草本，高70-120cm。根圆柱形，直径5-10mm，土黄色。茎有棱角或四方形，绿色或带紫色，有白色贴生或开展柔毛，或近无毛，分枝对生，节膨大。单叶对生；叶柄长5-30mm；叶片膜质，椭圆形或椭圆状披针形，长5-12cm，宽2-6cm，先端渐尖，基部宽楔形，全缘，两面被柔毛。穗状花序项生及腋生，长3-5cm，花期后反折；总花梗长1-2cm，有白色柔毛；花多数，密生，长5mm；苞片宽卵形，长2-3mm，先端长渐尖；小苞片刺状，长2.5-3mm，先端弯曲，基部两侧各有1卵形膜质小裂片，长约1mm；花被片披针形，长3-5mm，光亮，先端急尖，有1中脉；雄蕊长2-2.5mm；退化雄蕊先端平圆，稍有缺刻状细锯齿。胞果长圆形，长2-2.5mm，黄褐色，光滑。种子长圆形，长1mm，黄褐色。花期7-9月，果期9-10月，生长于海拔200米至1,750米的地区，常生长在山坡林下。

现今国内，牛膝栽培的传统方法是播种法，种子会携带虫卵，还有许多病害是种子带菌传播的，造成作物大范围的死亡，即使防治及时也会导致很多的损失和浪费，收获的产品因为质量差，价格偏低，在很大程度上限制了牛膝的生产。

发明内容

本发明针对上述问题提出了一种牛膝组培苗的获得方法，通过使用科学的植物组织培养技术，培育出不携带虫卵以及病菌的种苗。本发明包括下列步骤：

1)建立无菌植株：在5月份，选取色泽鲜亮、充实、饱满的牛膝种子，流水冲洗10-20分钟，在超净工作台上用70-75％的乙醇浸泡20-30秒，无菌水清洗3-5次，在浓度为0.3-0.5％的升汞中浸泡8-10分钟后，取出用蒸馏水冲洗3次后接种到1/2MS+GA₃(1-2mg/L)+蔗糖(1000-2000mg/L)培养基上，每个50ml三角瓶中8-10粒；培养光照为1500-2000lx，光照时间18小时/天，温度为26-28℃；黑暗处理6小时/天，温度为16-18℃，PH为5.8-6.2，每5-7天更新一次培养液。

2)切取外植体：上述步骤中的种苗连续培养23-25天后，选择无病、生长健壮的牛膝幼苗，切取带叶片茎段置于烧杯中，用纱布封口后流水冲洗2-3小时，用75％乙醇浸泡20-30秒，然后用0.1％升汞溶液灭菌5分钟后，立即用无菌水冲洗5次。

3)诱导培养：用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，在无菌条件下用剪刀将牛膝的所有叶片剪下，保留少许叶柄，再用小刀切割怀牛膝茎段，使每个茎段含两个对生的腋芽，长1-1.5cm；切割好后迅速接种于培养基上，培养基配方为：MS(500-800mg/L)+2，4-D(0.5-3.0mg/L)+椰子汁(200-500mg/L)+活性炭(500-1000mg/L)+琼脂(500-600mg/L)；培养条件与上述相同，连续培养15-20天。

4)生根培养：将分化出子叶的牛膝试管苗转移到生根培养上，培养基配方为：MS(500-800mg/L)+6-BA(0.5-2.0mg/L)+椰子汁(200-500mg/L)+蔗糖(800-1200mg/L)+活性炭(500-1000mg/L)+琼脂(500-600mg/L)；培养光照为2000-2500lx，光照时间16小时/天，温度为28-30℃；黑暗处理8小时/天，温度为16-18℃，PH保持在6.1，每5-7天更新一次培养液，连续培养15-20天后移栽大田。

本发明直接使用种子培养，选择合适的幼苗作为外植体进行愈伤组织诱导，从选择源头上就减少了病虫害隐患，培养出来的苗木数量多、品质优，本方法操作简单，成本投入少，适宜大规模推广。

具体实施方式

实例1

在5月份，选取色泽鲜亮、充实、饱满的牛膝种子流水冲洗10分钟，在超净工作台上用70％的乙醇浸泡20秒，无菌水清洗3次，在浓度为0.3％的升汞中浸泡8分钟后，取出用蒸馏水冲洗3次后接种到1/2MS+GA₃(1mg/L)+蔗糖(1000mg/L)培养基上，每个50ml三角瓶中8-10粒。培养光照为1500lx，光照时间18小时/天，温度为26℃；黑暗处理6小时/天，温度为16℃，PH为5.8，每5天更新一次培养液。