[发明专利]ERα36缺陷型SMMC-7721稳定转染细胞株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及到医学分子生物学技术，具体是采用shRNA干扰技术构建ERα36缺陷型SMMC-7721稳定转染细胞株的方法，研究细胞模型。

背景技术

Short Hairpin RNA(shRNA，翻译为“短发夹RNA”)，包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由pol III启动子控制，连上5-6个胸腺嘧啶T作为RNA聚合酶III的转录终止子。在活体中输送“小干扰RNA”(siRNA)的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”(shRNA)，并被RNAi通道处理，之后结合到RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，这种复合物能够结合并切割与siRNA序列相匹配的mRNA上，导致mRNA无法翻译成相应蛋白质，最终沉默细胞中相应蛋白的表达。shRNA整合入真核生物载体，利用U6或H1启动子确保其在宿主细胞内高效表达。这种载体能够整合入宿主细胞基因组中，并随着细胞增殖能够传递到子细胞中，因此，其基因沉默的能力得以延续。

RNAi技术是近年来快速发展起来的一项基因沉默技术，即在生物体细胞内，外源性或内源性的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引起同源mRNA特异性降解，从而抑制目的基因表达的技术。它的出现为分析基因功能和信号传导通路以及基因治疗方面都提供了一种新的研究手段。与传统的反义核酸、基因剔除等技术相比，具有特异性强、针对性强、级联放大等优点。

发明内容

鉴于国内外缺乏ERα36缺陷型的人肿瘤细胞株及其相关研究的报道，本申请应用shRNA系统沉默人肝癌SMMC-7721细胞内源性ERα36的表达，构建了ERα36缺陷型SMMC-7721稳定转染细胞株SMMC-7721/Sh36，并对其功能进行了研究。这一细胞模型可用于研究ERα36与肝癌的相关性及其机理；也可以用于研究雌激素在肝癌细胞中的信号传导通路；还可以作为研究雌激素的膜受体信号通路的细胞模型。

本发明所述的的SMMC-7721细胞株购于中科院上海细胞所，它是人类原发性肝癌细胞，贴壁生长。

本发明所述的ERα36缺陷型SMMC-7721稳定转染细胞株SMMC-7721/Sh36的获得过程包括，将SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核苷酸序列片段，插入携带GFP绿色荧光表达基因的pRNAT-U6.1/Neo表达载体，再将重组质粒转入SMMC-7721细胞株，在SMMC-7721细胞中表达shRNA，经阳性细胞克隆筛选到SMMC-7721/Sh36细胞株，使得siRNA靶向沉默了内源性ERα36的表达量30％以上，且95％以上的细胞表达绿色荧光蛋白的稳定转染细胞。

本发明所述的ERα36缺陷型SMMC-7721稳定转染细胞株的构建方法由以下步骤组成：

一、shRNA序列、DNA模板的设计与合成的思路

针对ER-α36mRNA 5’-CGAAGGGAAGTATGGCTATGGAATCC-3’为目标设计shRNA，再分别合成两条互补并含siRNA的正义链和反义链的DNA模板，中间以10个脱氧核苷酸的Loop结构相连，后接RNA PloyIII转录终止位点，并在两端引入BamH I和HindIII酶切位点。

综上，设计了对应ER-α36基因的shRNA DNA模板为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，送大连宝生物公司合成引物序列。

本发明的一方面在于：ERα36缺陷型SMMC-7721稳定转染细胞株的构建方法，其包括如下步骤：

(a)设计对应ER-α36基因的shRNA的两条单链DNA模板，其碱基序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；

(b)构建含有上述碱基序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的pRNAT-U6.1/Neo重组质粒；

(c)利用如步骤(b)获得的重组质粒转染宿主细胞SMMC-7721得到的重组细胞株；

(d)将步骤(c)所得重组细胞株经过G418筛选培养基培养，每3～5天更换一次筛选培养基，筛选10～14天，获得阳性克隆细胞株；其中，所述的G418筛选培养基为15％新牛血清的RPMI-1640培养基中，加入G418使其终浓度为500ug/mL；