[发明专利]ERα36缺陷型SMMC-7721稳定转染细胞株及其构建方法无效
| 申请号： | 201110455979.8 | 申请日： | 2011-12-30 |
| 公开（公告）号： | CN102559679A | 公开（公告）日： | 2012-07-11 |
| 发明（设计）人： | 邹伟;崔风宫;张媛;方晨 | 申请（专利权）人： | 辽宁师范大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/63;C12N5/10;C12R1/91 |
| 代理公司： | 大连东方专利代理有限责任公司 21212 | 代理人： | 贾汉生 |
| 地址： | 116029 *** | 国省代码： | 辽宁;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | er 36 缺陷 smmc 7721 稳定 转染 细胞株 及其 构建 方法 | ||
1.ERα36缺陷型SMMC-7721稳定转染细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)设计对应ER-α36基因的shRNA的两条单链DNA模板，其碱基序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
(b)构建含有上述碱基序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的pRNAT-U6.1/Neo重组质粒；
(c)利用如步骤(b)获得的重组质粒转染宿主细胞SMMC-7721得到的重组细胞株；
(d)将步骤(c)所得重组细胞株经过G418筛选培养基培养，每3～5天更换一次筛选培养基，筛选10～14天，获得阳性克隆细胞株；其中，所述的G418筛选培养基为15％新牛血清的RPMI-1640培养基中，加入G418使其终浓度为500ug/mL；
(e)将步骤(d)筛选所得的阳性克隆细胞株利用Western Blotting方法，和/或细胞计数法，和/或软琼脂糖集落形成实验法检测。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(b)所述的构建方法包括如下步骤：
(f)取SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2两条单链DNA模板等浓度混匀后，经95℃加热10min，室温静置1h，稀释至终浓度10ng/ul；
(g)用T4DNA连接酶将步骤(f)所得产物与BamH I和HindIII酶切后的线性化载体pRNAT-U6.1/Neo在22℃连接2h；
(h)将步骤(g)获得的连接产物转化感受态E.coli DH5α后，经细胞培养、提取质粒、测序鉴定结果如SEQ ID NO：3。
3.如权利要求1或2所述的构建方法所获得的ERα36缺陷型SMMC-7721稳定转染的细胞株。
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