[发明专利]靶向小胶质细胞的基因-载体复合物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种具有细胞靶向性的基因-载体复合物，还涉及该基因-载体复合物的制备方法和应用。

背景技术

小胶质细胞作为中枢神经系统中参与免疫反应的主要效应细胞，在炎症反应中发挥重要作用。当有外来病原体入侵或有细胞死亡，小胶质细胞会迅速被激活并将其清除，同时释放炎症因子介导炎症反应。但有研究表明，过度活化的小胶质细胞可能加速某些中枢神经系统疾病的进程，而其释放的细胞毒性因子也会对神经细胞造成进一步的损伤。例如，在阿尔茨海默氏症中发现，与神经炎斑块所在的皮层相同区域存在活跃的小胶质细胞；在帕金森氏症中发现，退行性病变主要存在区域——黑质中存在大量活化的小胶质细胞；在多发性硬化中，早期病变中的轴突损害程度与小胶质细胞的活化程度相对应。目前，由小胶质细胞介导的炎症反应被认为是多种神经系统疾病发生或恶化的机制，活化的小胶质细胞通过释放促炎症因子、细胞毒素等多种机制损害神经元及髓鞘。因此，适当抑制小胶质细胞的活化可能是治疗中枢神经系统疾病的有效途径。

CX3C趋化因子受体1（CX3CR1）在中枢神经系统中主要在小胶质细胞上表达，其特异性配体CX3CL1属于CX3C家族的δ类趋化因子，主要由神经元分泌。CX3CL1通过CX3CR1受体可促进小胶质细胞的趋化、增殖、存活，细胞内钙水平的升高以及细胞因子和金属蛋白酶的分泌，这些反应能被抗CX3CR1抗体阻止。因此，如果能够有效干扰CX3CR1受体的表达，则理论上可以抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的神经系统疾病的发生或恶化。

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是大多数真核生物体内一种调控基因表达的方式，主要通过小干扰RNA（Small interfering RNA, siRNA）特异性地沉默靶基因的表达，具有高效性、特异性等优点，已被广泛应用于基因功能、细胞信号转导通路、药物靶点筛选、基因治疗等研究领域。因此，可以利用RNAi技术干扰CX3CR1受体的表达。但RNAi技术也面临一个关键问题，就是如何将siRNA有效地传递进入靶细胞。由于siRNA容易被核酸酶降解且真核细胞不易摄取外源性的裸露核酸，直接用siRNA转染细胞效率低下，因此，必须选择适当的载体包裹siRNA，以免siRNA降解并且能够辅助siRNA转染细胞。壳聚糖是从甲壳类生物的贝壳中提取出来的一种多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，作为药物载体得到广泛应用。壳聚糖富含正电荷，可通过静电作用与带负电荷的siRNA结合，包裹siRNA形成壳聚糖-siRNA纳米粒，从而保护siRNA免受核酸酶的降解，并提高细胞对siRNA的摄取。研究发现，壳聚糖载体携带的siRNA能够高效的转染细胞，同时延长siRNA在体内的半衰期。但壳聚糖载体与目前大多数的病毒和非病毒基因载体一样，都存在缺乏细胞靶向性的缺陷，从而限制了其在基因治疗中的应用。

US28是人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）编码的四个七次跨膜趋化因子受体之一，具有广谱趋化因子结合活性，在结构上与人源CX3CR1受体的同源性最高。研究发现，来源于US28受体N末端的诱惑配体多肽H9可以阻断人源CX3CR1受体结合生理性趋化因子形成的趋化作用，但其本身不引起趋化运动，不影响胞内信号转导和细胞自然活性；其能够引起细胞表面受体CX3CR1内化，但内化的受体部分能够再循环到细胞表面，对人源CX3CR1受体的生理功能没有明显影响。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基因-载体复合物，该复合物可以成功靶向小胶质细胞，干扰CX3CR1受体的表达，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的神经系统疾病的发生或恶化。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

靶向小胶质细胞的基因-载体复合物，由CX3CR1 shRNA干扰载体与基因载体通过静电作用结合而成，所述基因载体为H9多肽与壳聚糖的偶联物。

优选的，所述CX3CR1 shRNA干扰载体中含有正义链如SEQ ID No.2所示、反义链如SEQ ID No.3所示的shRNA序列。

优选的，所述CX3CR1 shRNA干扰载体是以pSilencer 2.1-U6neo载体为基础载体。

优选的，所述H9多肽与壳聚糖的偶联物是用1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺将H9多肽的羧基与壳聚糖的氨基进行偶联。