[发明专利]一种重组胰蛋白酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种重组胰蛋白酶的制备方法。

技术背景

胰蛋白酶Trypsin(Parenzyme)是一种丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21.4)。在无脊椎和脊椎动物中作为消化酶而广泛存在。不同物种的胰蛋白酶分子大小有一定差异，牛胰蛋白酶由223个氨基酸残基组成，分子量为23300，等电点为10.1-10.5。胰蛋白酶在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的，通过胰液而分泌，在肠道中受肠激酶作用分解成为具有活性的胰蛋白酶。它是肽链内切酶，可从肽链中赖氨酸或精氨酸残基中的羧基侧切断肽链。因为胰蛋白酶是特异性最强的蛋白酶之一，在消化道内，它不仅起消化酶的作用，而且还能限制性分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，对这些酶原起活化作用；在蛋白质研究及工业上，它作为重要的工具酶，在蛋白质测序、动物细胞培养前对组织的处理、胰岛素等蛋白药物的生产、皮革与生丝处理以及食品工业上发挥广泛的作用；在临床上，还可用于清除脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。

目前胰蛋白酶主要从猪、牛的胰脏中提取，因其动物源性，存在未知病毒和外源因子污染的风险，在制药行业的应用受到很大的限制；另外通过动物脏器提取的胰蛋白酶，因分离纯化不彻底，存在一些杂质，如糜蛋白酶，对其特异性切割赖氨酸和精氨酸位点产生影响，在蛋白药物的生产和分析中的应用也受到较大的限制。通过重组工程菌表达胰蛋白酶原，可以生产高纯度与高活力的胰蛋白酶，可以满足蛋白质研究与药物蛋白生产的需要。

本领域需要提供新的胰蛋白酶的制备方法。

发明内容

本发明的发明人经过大量和富有创造性的工作，构建了包含胰蛋白酶原基因的重组细胞株并经优化表达条件、纯化最终获得了与胰蛋白酶序列一直的重组胰蛋白酶，从而完成了本发明。

本发明所要解决的技术问题之一是，提供一种包含胰蛋白酶原基因的表达载体。

本发明所要解决的技术问题之二是，提供一种包含胰蛋白酶原基因的工程菌。

本发明还要解决的技术问题之三是提供一种重组胰蛋白酶的制备方法。

本发明提供了一种包含牛胰蛋白酶原基因的表达载体，其特征在于牛胰蛋白酶原基因序列为Seq ID No.16-710。优选地，包含牛胰蛋白酶原基因的表达载体，其特征在于，牛胰蛋白酶原基因Seq ID No.16-710插入质粒pET-22b(+)的McsI/XhoI酶切位点。

牛胰蛋白酶原基因序列在本领域是已知的，公布在Genebank中，具体参见Seq.ID No.16-710，其编码Seq.ID No.2的牛胰蛋白酶原序列。获得该序列的方法在本领域也是已知的，例如可以采用人工合成的方法合成该序列。为插入质粒pET-22b(+)的McsI/XhoI酶切位点，在合成牛胰蛋白酶原cDNA时，两端分别添加了McsI/XhoI酶切位点，Seq.ID No.11-8和711-716，参见序列表。

本发明提供了一种包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌，其包含前述的表达载体。优选地，包含牛胰蛋白酶原基因序列的工程菌，其特征在于，由将前述表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)而获得。转化方法在本领域是公知的，例如电穿孔法、CaCl₂转化法等。

本发明还提供了一种重组牛胰蛋白酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌并诱导牛胰蛋白酶原基因表达；

(2)收集菌体；

(3)破碎菌体；

(4)收集包涵体，洗涤包涵体；

(5)包涵体变性和复性；

(6)胰蛋白酶原活化；

(7)活化的胰蛋白酶纯化。

所述的“收集菌体”的方法包括但不限于离心包括连续离心、过滤等。

所述的“破碎菌体”的方法，包括但不限于高压匀浆、渗透压冲击、冻融、超声波破碎等。

所述的“收集包涵体”的方法，包括但不限于离心。

所述的“洗涤包涵体”的方法，包括但不限于包涵体用纯化用书或者合适的缓冲液重悬、离心、再重悬离心等2～3个循环操作。

包涵体变性和复性的方法可以按照本领域的技术人员公知的方法进行。