[发明专利]一种重组胰蛋白酶的制备方法

权利要求书

1.一种包含牛胰蛋白酶原基因的表达载体，其特征在于牛胰蛋白酶原基因序列为Seq ID No.16-710。

2.根据权利要求1的表达载体，其特征在于，牛胰蛋白酶原基因Seq ID No.16-710插入质粒pET-22b(+)的McsI/XhoI酶切位点。

3.一种包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌，其包含权利要求2所述的表达载体。

4.一种包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌，其特征在于，由将权利要求2所述的表达载体转化大肠杆菌BL21DE3而获得。

5.一种重组牛胰蛋白酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养权利要求3或4任一所述的牛胰蛋白酶原基因的工程菌并诱导牛胰蛋白酶原基因表达；

(2)收集菌体；

(3)破碎菌体；

(4)收集包涵体，洗涤包涵体；

(5)包涵体变性和复性；

(6)胰蛋白酶原活化；

(7)活化的胰蛋白酶纯化。

6.根据权利要求5的制备方法，其特征在于：步骤(1)培养包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌并诱导牛胰蛋白酶原基因表达具体为：接种重组工程菌阳性克隆200μl到20ml的LB培养基中，于30℃下摇床振荡培养过夜，按4％-10％接种量接过夜菌于500ml的LB培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度37℃，搅拌速度300rpm，通气量15L/min，pH为6.7，控制搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在30％以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中pH调控；当培养基中养分耗尽、溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30％以上；补料4hr-6hr后，降温至20-30℃，调节pH至6.5-7.5，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20％，继续培养4-10h后出罐，收集菌体。

7.根据权利要求5的制备方法，其特征在于，包涵体变性和复性的条件是：包涵体溶解缓冲液：0.2mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/LTis-HCL，PH7.5，按重量体积比1∶5～15溶解过夜；溶解后的包涵体经离心，稀释到蛋白浓度0.1～0.5mg/ml，在复性缓冲液：0.2mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/L Tis-HCL，GSH∶GSSG＝1mmol/L∶0.3mmol/L，PH10中，4℃复性过夜。