[发明专利]一种抗HER2或/和抗HER3抗体蛋白的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种抗HER2或/和抗HER3抗体蛋白的纯化方法。

背景技术

随着生物医药技术的发展，越来越多的哺乳动物细胞用于生产治疗性重组蛋白质，比如：单克隆抗体、细胞因子、激素、生长因子、其它还有某些酶类、凝血因子等。涉及到的治疗领域也越来越广泛，包括内分泌、心脑血管、外科、血液病、抗肿瘤等等。

治疗性重组蛋白的生产过程中，人们常根据每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异通过采用离子交换(IEX)、凝胶过滤(GF)、疏水(HIC)、反相(RPC)、亲和(AC)等多种方法组合分离出目的蛋白，比如单克隆抗体，从细胞发酵上清液产生后，需要经过多个步骤的纯化过程，才能达到足够的纯度，用于人体的注射。发酵料液的成分非常复杂，而目的蛋白只占其中很小的部分，蛋白纯化步骤越多，目的蛋白的回收率就越低。如市面上销售的抗HER2的单克隆抗体药物是由美国Genentech公司生产，其纯化工艺流程为：细胞上清收获、蛋白A层析、低pH病毒灭活、阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析。此工艺的不足有：1)层析步骤多，有四个层析过程。2)无病毒过滤步骤。具有潜在病毒风险。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有抗HER2或/和抗HER3纯化方法的问题，提供了一种抗HER2或/和抗HER3的纯化方法，以便能简化纯化步骤，提高目的蛋白的回收率，且能清除病毒，降低潜在病毒风险。

为此，本发明公开了一种抗HER2或/和抗HER3抗体蛋白的纯化方法，包括下列步骤：

澄清发酵液；

亲和层析；

酸性pH值病毒灭活；

阳离子交换层析；

阴离子交换层析；

病毒过滤；其中所述酸性pH值病毒灭活步骤和病毒过滤步骤可随意穿插在亲和层析步骤后任一步骤位置。

在一些实施例中，所述抗HER2或/和抗HER3抗体蛋白为抗HER2抗体蛋白。

在一些实施例中，所述发酵料液的澄清方式为离心、深层过滤或终端微滤中之一或任何组合，可根据发酵料液的状态和处理体积，可采用不同的处理方式或组合。其中优选深层过滤，最优选为采用两级深层过滤，滤膜为Millipore公司D0HC和A1HC滤膜。深层过滤是比较新的一种过滤方式，它采用了疏松多空的纤维素骨架结构，并填充了硅藻土成分，进样端的表面孔径成漏斗状，这些结构摈弃了传统微滤表面截留结构易造成阻塞、过滤效率低的缺点，又具备了离心机所没有的截留小体积细胞碎片的优势，同时依靠硅藻土的吸附作用，能截留高达50％的DNA和15％的HCP。

在一些实施例中，所述抗HER2或/和抗HER 3抗体蛋白具有的标签蛋白或标签多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽-S-转移酶(GST-Tag)、六聚组氨酸肽(His-Tag)、Arg-tag、蛋白质A(protein A)、FLAG-Tag和Strep-tag等。通过特殊性蛋白或多肽与目标蛋白构成融合蛋白的形式，表达后利用所述的标签蛋白或标签多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。如His-Tag与Ni-Chelating Sepharose柱特异性结合；Arg-tag可结合到阳离子交换树脂SP-Sephadex上；GST-Tag与交联谷胱甘肽的层析介质结合；所述的标签蛋白或标签多肽可以在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、肠激酶和Xa因子等，以获得目标蛋白。

在一些实施例中，所述亲和层析为蛋白A亲和层析，利用蛋白A对抗体Fc片段高特异性的吸附，能够达到95％以上的抗体回收率和99％以上的纯度。

所述蛋白A亲和层析的条件为流速：300±100cm/h；柱高：20±2cm；平衡缓冲液：25mM Tris-HCl+75mM NaCl，pH 7.2±0.2；洗脱液：100mM醋酸钠，pH 3.6±0.1。

所述酸性pH值病毒灭活为调整pH值至微酸性(pH值约3.7)。在该pH值下，膜病毒的外膜破坏，失去感染性。但是，对于没有外膜的病毒类型，则无灭活效果。所述酸性pH值病毒灭活步骤为加入20％乙酸，调整pH值到3.7±0.1，室温放置1-2小时，加入2M Tris调整pH值到5.2±0.2。