[发明专利]用于T淋巴细胞的体外培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于处理人外周血、脐带血、胸水、腹水等样品中的单个核细胞成为细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-Induced Killer，简称CIK）的方法，特别是一种用于T淋巴细胞的体外培养方法，该方法可以应用于临床细胞生物治疗，也可以应用于基础医学研究、临床应用研究及生物技术研究，尤其可以应用于免疫系统研究和肿瘤杀伤作用的研究。

背景技术

随着肿瘤对人类生存健康的威胁日益严重，应对肿瘤的治疗模式也发生着日新月异的变化，各种新药物、新技术、新方法层出不穷，其中细胞生物治疗是继手术、放疗和化疗后发展的第四类肿瘤治疗方法，成为肿瘤生物治疗中重要的发展方向。癌症是肿瘤细胞逃脱免疫监视系统的细胞疾病，机体免疫功能的缺陷是癌症发生和发展的关键。机体的抗肿瘤免疫主要为T淋巴细胞所介导。细胞生物治疗技术将自体免疫细胞经体外诱导、分化、扩增再回输至体内，绕过体内肿瘤免疫障碍机制，通过激发机体的免疫反应来对抗、抑制和杀灭癌细胞。继淋巴因子激活杀伤细胞、浸润肿瘤淋巴细胞及分化抗原（Cluster of Differentiation, 简称CD）3单抗激活的杀伤细胞后，CIK的杀瘤作用日益受到重视。

CIK细胞是1991年由美国斯坦福大学施密特等首次报道。他们发现在体外模拟人体内环境的条件下，外周血淋巴细胞可以被多种细胞因子定向诱导并增殖为一群具有高效细胞毒活性的异质效应细胞。由于该细胞群同时表达CD3、CD8和CD56膜蛋白分子，故又称为自然杀伤细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和自然杀伤细胞的非主要组织相容性复合物限制性杀瘤的优点，可特异性聚集于肿瘤局部发挥抗瘤杀瘤作用。CIK细胞在体内归巢于脾脏和淋巴结，在肝脏中分布最多，其次是外周血。其中CD3⁺、CD8⁺、CD56⁺是CIK细胞群中的主要效应细胞，在正常人外周血中仅占淋巴细胞的1-5%，而在体外经多种因子刺激培养10-25天后，细胞数量较培养前可增加1000倍以上。

与其他过继性免疫治疗细胞相比，CIK细胞具有增殖快、杀瘤活性强、杀瘤谱广、副作用小、对正常骨髓造血影响轻微等优点。对化疗耐药的肿瘤细胞株有杀伤作用，而对正常造血集落细胞的生长没有影响。通过取病人少量单个核细胞，在体外特定条件下制备出大量CIK细胞，回输体内后直接发挥有效清除肿瘤作用，尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，并实现了延长患者生存期，快速提高患者生活质量等多重目标。因此，CIK被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的优选细胞。目前肿瘤生物治疗中心应用树突状细胞（Dendritic Cell，简称DC）和CIK细胞联合回输的方法，用于恶性黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌、食道癌、胃癌、膀胱癌等疾病治疗。但目前各个实验室培养CIK的方法，使用材料，培养时间均不一致，导致有效细胞的培养周期、质量和数量参差不齐，给临床应用带来了效果不稳定的风险因素。

另外，在中国专利申请号为200910045790.4的“一种CIK细胞及其制备方法和细胞制剂”中，公开了一种CIK细胞及其制备方法和细胞制剂。其记载的CIK细胞的诱导因子组合为植物血凝素、抗CD3单抗和抗CD28单抗。该方案中所使用的植物血凝素是一种有丝分裂原，能激活小淋巴细胞转化为淋巴母细胞，继而分裂增殖，释放淋巴因子，提高巨噬细胞的吞噬功能，但由于其较难提纯，且成本极高，所以一直以来仅在实验室中作为刺激淋巴细胞增殖的试剂，很难应用于临床的大规模使用。在中国专利申请号为200310109565.5的“一种CIK细胞体外培养方法”中，公开了一种CIK细胞体外培养方法。该培养方法同样采用了植物血凝素和抗CD3单克隆抗体两种有丝分裂原联合激活细胞，虽然能够增强细胞的刺激强度，但该方法需要借助生物反应器完成，不仅成本高，使用不方便，且不利于医学研究和临床应用。

综上，现有CIK细胞（T淋巴细胞）体外培养方法急需改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于T淋巴细胞的体外培养方法，该培养方法可以用于T淋巴细胞体外定向分选、诱导、分化、培养、扩增。

本发明所采用的技术方案是：该用于T淋巴细胞的体外培养方法，包括对T淋巴细胞进行定向分选、诱导、分化、培养、扩增，其技术要点是：具体操作步骤如下：

第一步、对T淋巴细胞进行定向分选：