[发明专利]用于T淋巴细胞的体外培养方法

权利要求书

1.一种用于T淋巴细胞的体外培养方法，包括对T淋巴细胞进行定向分选、诱导、分化、培养、扩增，其特征在于：具体操作步骤如下：

第一步、对T淋巴细胞进行定向分选：

将稀释好的血细胞以1：1的比例缓慢注入细胞分选液上，并离心处理；用移液管吸出分选后的第一层液体即血浆或细胞组织均浆液层，弃去，吸取第二层细胞即环状乳白色淋巴细胞于新的离心管中；向新收集的细胞中补加生理盐水，离心处理后弃上清；重复洗两次；其中细胞分选液的配制方法为：取9% Ficoll溶液720ml与33.4%泛影葡胺30ml充分混合，再向该混合液中加入7.5g的明胶，充分混匀；用高浓度的泛影葡胺或稀释的Ficoll来调整溶液的相对密度至1.077g/ml；最后放入温度为121℃的高压蒸汽灭菌中30min，室温保存备用；

第二步、对T淋巴细胞进行诱导、分化、培养：

取包被瓶一个，所述包被瓶是预先包被了CD3单克隆抗体、γ-干扰素、白细胞介素-1α三种因子的细胞培养瓶，用生理盐水或培养基润洗一次并弃去，加入患者自体血浆2~5ml；取培养基重悬细胞，混匀后将其移入包被瓶中；而后用培养基润洗离心管，将润洗液再次移入包被瓶中；将包被瓶放入5% CO₂、37℃的培养箱中培养24h；

包被瓶的制备：取CD3单克隆抗体、γ-干扰素、白细胞介素-1α加入到40ml磷酸盐缓冲液中，CD3单克隆抗体、γ-干扰素、白细胞介素-1α三种因子的浓度比例为10:1:1，制成总浓度为1200ng/ml的混合溶液，充分混匀；将该混合溶液加入到600ml培养瓶中，4℃静置至少24小时，制成初始包被瓶；将初始包被瓶在-40℃条件下冷冻24小时；启动冷冻干燥机的压缩机，使机器腔室内的温度降至-40℃，将包被瓶瓶口拧松，放入干燥室；开启真空泵，使压力达到<15Pa，真空冻干20小时；打开CO₂进气阀，关闭真空泵；待压力到110K后关闭CO₂进气阀，取出包被瓶，拧紧盖子，封好口，4℃保存；在规定的保质期内使用；

第三步、对T淋巴细胞进行扩增：

吸取新鲜培养基溶解细胞因子A，即20万单位的白细胞介素-2，注入包被瓶中，此时细胞因子A在培养瓶中的浓度为0.4万单位/ml；于5%CO₂，37℃培养箱中培养2~3天后，向包被瓶中补加新鲜培养基100ml；再于5% CO₂，37℃培养箱中继续培养1~2天，当细胞基本铺满包被瓶底时，进行转袋；

用移液管吹下包被瓶中的贴壁细胞，用注射器吸取新鲜培养基溶解细胞因子B，即200万单位的白细胞介素-2，加入包被瓶中，同时加入患者自体血浆2~5ml，将培养瓶中的细胞培养液倒入培养袋中；用新鲜培养基润洗包被瓶两次，将润洗液一并倒入培养袋中，补加培养基至1000ml，此时细胞因子B在培养瓶中的浓度为0.2万单位/ml；将培养袋放入5%CO₂，37℃培养箱中培养3~4天后，补加新鲜培养基1000ml，继续放入5%CO₂，37℃培养箱中培养；补液后第二天，进行检菌，证明培养袋中的培养物是否可以用于回输治疗或医学研究。

2.根据权利要求1所述的用于T淋巴细胞的体外培养方法，其特征在于：还包括检菌、回输步骤：

所述检菌时，取出培养袋，用注射器由取样口吸取培养物分别注入两个双相血培养瓶中，一瓶送与第三方进行无菌检测，一瓶用于自检；将双向血培养瓶置于37℃恒温培养箱中培养；双相血培养瓶培养3天后若无菌生长，证明培养袋中的培养物可以用于回输治疗或医学研究；

回输时，准备离心管8个，将培养物倒入离心管中，剩余培养物放回培养箱继续培养；4℃条件下，离心处理弃去上清，用生理盐水重悬细胞并集中到2个离心管中；4℃条件下，离心处理弃去上清；用生理盐水重悬细胞并集中到1个离心管中；4℃条件下，离心处理弃去上清，用生理盐水重悬细胞；4℃条件下，离心处理弃去上清，用生理盐水重悬细胞；用注射器吸取一只细胞分散剂注入新的离心管中，该细胞分散剂为10%人血清白蛋白，而后将无菌筛网放到该离心管上；吸取细胞悬液，注入装有无菌滤器的离心管中；通过滤网滤去大的细胞团；取回输袋一个，倒入细胞并加生理盐水备用。

3.根据权利要求1或2所述的用于T淋巴细胞的体外培养方法，其特征在于：用于处理人外周血、脐带血、胸水、腹水中的单个核细胞的体外定向分选、诱导、分化、培养、扩增。