[发明专利]用于外源蛋白可溶性表达的质粒及其制备和应用方法

说明书

本发明专利申请为中国发明专利申请号201010266983.5，申请日2010年8月31日，申请人“上海交通大学”，发明名称“用于外源蛋白可溶性表达的质粒及其制备和应用方法”的分案申请。

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的质粒及其制备和应用方法，具体是一种利用产肠毒素大肠杆菌FaeE基因提高外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的质粒及其制备和应用方法。

背景技术

大肠杆菌具有遗传性状了解透彻、生长快、培养经济、表达水平高、待选质粒和宿主多等特点，在基因工程技术领域成为首选的表达系统。但是外源蛋白往往在获得高水平表达的同时，容易被宿主蛋白酶降解或者形成包涵体。目前国内外对蛋白质体外复性研究较多，但其过程往往费时、费力，且不经济，因此，探索外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有较高的学术价值和广泛的应用前景。

提高外源基因大肠杆菌中可溶性表达可以通过共表达的辅助蛋白，例如分子伴侣GroEL/ES和DnaK-Dnaj-GrpE、引发因子(Trigger factor)、硫氧还蛋白(Thioredoxin)和折叠酶(Foldase)等以增加外源蛋白可溶性。但是应根据外源蛋白的特点有选择性地共表达分子伴侣和折叠酶。例如在大肠杆菌中共表达热激蛋白GroEL/ES能增加某些蛋白(α-1，6-岩藻糖基转移酶、浸麻芽孢杆菌环式糊精葡聚糖转移酶、谷氨酸消旋酶、过氧化物歧化酶、酪氨酸激酶、人胶原酶原)的可溶性，却对其他一些蛋白(人I型干扰素受体2c亚基的胞外段、噬菌体P22结构蛋白、人酸性富含胱氨酸分泌型蛋白)无增溶效果。又如GroEL/ES与人酪氨酸激酶Lck共表达并不能增加后者的可溶性，而硫氧还蛋白却能显著地促进该外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。除此之外，温度也可能会对共表达折叠辅助蛋白的效果产生重要的影响。例如preS2-S’-β-半乳糖苷酶与DnaK和DnaJ分子伴侣共表达，能在30至42℃范围内提高可溶蛋白的表达水平，而共表达GroEL和GroES分子伴侣却只能在30℃条件下取得比较好的效果。值得一提的是，如果将几种折叠辅助蛋白分子同时共表达，有可能获得比单独表达某种折叠辅助蛋白更好的效果。Jiro等将GroEI/ES，Trx或DsbBD与谷氨酸消旋酶同时共表达，活性谷氨酸消旋酶的产量上升了2.2至2.3倍。在某些情况下，共表达那些能增加蛋白可溶性和促进大肠杆菌生长的蛋白也能起到良好的效果。例如Kallio等在大肠杆菌中共表达透明颤菌血红蛋白，发现该蛋白对活性蛋白的表达有明显促进作用。

FaeE是产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白上的一个分子伴侣，在体内以同源二聚体的形式与鞭毛蛋白的其他亚基形成异源三聚体，从而保护这些亚基免受蛋白酶的降解，同时抑制这些亚基提前聚合，并将它们护送到跨膜蛋白。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种用于外源蛋白可溶性表达的质粒及其制备和应用方法，该方法构建了一个包含有该分子伴侣FaeE的大肠杆菌表达载体，可以促进外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种用于外源蛋白可溶性表达的质粒，该质粒为pET30e其DNA序列如Seq ID No.1所示，

所述的质粒包含有分子伴侣FaeE的编码序列，含有BamH I，EcoR I，Sac I，Sal I，Not I，Xho I限制性内切酶识别位点组成的多克隆位点，其分子伴侣FaeE的编码序列包括有起始密码子ATG和终止密码子TAA，分子伴侣FaeE的编码序列和外源基因序列之间有一个大肠杆菌核糖体结合位点，分子伴侣FaeE的编码序列和外源基因序列共同受T7启动子和1ac操纵子的调控，外源基因序列末端与6个His-tag基因融合；

本发明涉及上述用于外源蛋白可溶性表达的质粒的制备方法，通过将质粒模板与引物组进行PCR扩增后获得的扩增产物与pMD18-T载体连接，经转化大肠杆菌DH5α后获得大肠杆菌克隆体，将大肠杆菌克隆体作为底物进行酶切连接后将得到的产物转化大肠杆菌DH5α，获得可溶性表达质粒分子。

所述的大肠杆菌DH5α购自上海英骏生物技术有限公司；

所述的pMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司；

所述的将质粒模板与引物组进行PCR扩增是指：

a)将F4ac型ETEC野生型菌株C83907质粒与第一引物和第二引物进行PCR扩增；或