[发明专利]CYP2C19基因检测试剂盒及其扩增方法和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测SNP位点的试剂盒及其PCR扩增方法，尤其是利用多重PCR结合分子开关技术检测CYP2C19酶活性相关的SNP位点的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测方法。

背景技术

细胞色素P450是一组结构和功能相关的超家族基因编码的同工酶，在药物代谢中占有重要地位。大多数的药物进入体内后均需进行生物转化。生物转化主要包括I相反应和II相反应两个过程。I相反应涉及的代谢酶主要为肝细胞内质网的细胞色素P450酶系。细胞色素氧化酶P4502C19(CYP2C19)又称为S-美芬妥英羟化酶，是细胞色素P450的一个成员，其活性存在明显的个体差异，影响许多临床药物的代谢，对不同个体的药物治疗作用和不良反应及药物的毒性产生重要影响

1993年Wrighton等证明S-美芬妥英在人肝脏中由CYP2C19编码表达的羟化酶氧化为4’-羟基美芬妥英，根据美芬妥英羟化代谢的水平可以判断CYP2C19酶的活性。1994年Morais发现2C19上的2个多态性：m1(*2rs4244285)、m2(*3rs4986893)可以造成S-美芬妥英弱代谢，这两个多态性可以解释＞99％东方人的CYP2C19遗传多态性的弱代谢者的等位基因。CYP2C19*2是第5外显子第681位的碱基发生G→A变异，使得转录时在第5外显子的初始段丢失了40bp(634～682bp)的片段，从而改变了mRNA的阅读框架，提前产生一个终止密码，形成一个234个氨基酸的蛋白质缺失血红素结合区，从而丧失了催化活性。CYP2C19*3是第4外显子第636位处的碱基发生G→A变异，使212位原来编码色氨酸的密码子变为终止密码子，从而产生仅由211个氨基酸组成的没有活性的蛋白质。2006年Sim SC等发现一个新的SNP：-806C＞T(*17rs12248560)，可以造成S-美芬妥英极快速代谢，在亚洲人群中约5％的人群携带。

研究发现，CYP2C19参与许多药物代谢，如S-美芬妥英、苯巴比妥、丙戊酸(抗癫痫药)，奥美拉唑、雷贝拉唑(质子泵抑制剂)，氯胍、氯二胍(抗疟疾)，甲苯磺丁脲(降血糖药)，丙米嗪、氯丙米嗪、阿米替林(抗抑郁药)，地西泮、去甲地西泮(镇静、安眠药)等。CYP2C19酶活性存在多态性，因此不同的个体对药物代谢能力不同，产生的药物毒副作用及治疗效果不同。氯吡格雷是目前世界范围内使用最广泛的噻吩吡啶类抗血小板药，用于急性冠买综合征、冠脉支架术和冠心病的治疗。氯吡格雷属于前体药，其经过CYP2C19酶代谢后的活性产物才能发挥抗血小板的疗效。FDA和美国心脏病学会建议，对于CYP2C19慢代谢型患者需要增加氯吡格雷剂量或者考虑改变治疗方案。奥美拉唑是目前应用最为广泛的质子泵抑制剂之一。伏立康唑是一种光谱的三唑类抗真菌药。这两种药都是由CYP2C19酶主要代谢的，CYP2C19快代谢者，会出现疗效不佳；CYP2C19弱代谢者，会出现严重不良反应。检测CYP2C19基因型，可以更精确地调整药物剂量。丙戊酸钠和丙戊酸镁是目前治疗全身性或部分性癫痫的首选药，但丙戊酸的代谢产物具有一定的肝毒性，对肝脏有损害。CYP2C19快代谢者相对于慢代谢者更容易出现肝毒性等不良反应。对于快代谢型者患者建议慎用丙戊酸。

发明内容

CYP2C19基因上三个中国人常见SNP直接影响CYP2C19酶的活性，影响多重药物的疗效和毒副作用。本发明提供一种利用多重PCR结合分子开关技术对CYP2C19基因进行基因检测的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测方法。

本发明采用的技术方案：一种CYP2C19基因检测试剂盒，所述试剂盒包括检测基因CYP2C19rs4244285位点、rs4986893位点和rs12248560位点的引物。

所述试剂盒包括检测CYP2C19基因rs4244285位点的两个正向引物及一个反向引物、检测CYP2C19基因rs4986893位点的两个正向引物及一个反向引物和检测CYP2C19基因rs12248560位点的两个正向引物及一个反向引物。

所述检测CYP2C19基因rs4986893位点的引物碱基序列如下所示：

正向野生型引物：TTCCCACTATCATTGATTATTTCCCG

正向突变型引物：TTCCCACTATCATTGATTATTTCCCA

反向共用引物：TGAATCACAAATACGCAAGCAGTCAC

所述检测CYP2C19基因rs4986893位点的引物碱基序列如下所示：