[发明专利]一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，更具体涉及一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法，同时还涉及一种芒属植物Genic-SSR标记的用途。

技术背景

芒属植物属于禾本科C4多年生草本植物，主要包括芒、五节芒、荻、南荻、奇岗，集中分布在亚洲东部及东南部。芒属植物具有生命力强、光合利用效率高、抗逆性强等特点，可用于制药、造纸、水土保持和生态修复等。随着人类对能源需求的不断提高，全球能源储量的不断减少，芒属植物作为一种潜在的能源植物越来越受到人们的高度关注。目前，在欧美实现广泛种植的奇岗，年产可达每年10～40吨/公顷，被用于火力发电和燃料乙醇生产。随着芒属植物的遗传多样性研究、遗传选育改良及遗传图谱绘制等工作的不断深入，对芒属植物分子标记的需求也越来越大。通过遗传改良或重要基因的挖掘可有效提高芒属能源植物的产量、抗逆性、广适性。因此，挖掘芒属植物的分子遗传标记，对芒属植物研究意义重大。

简单序列重复(simple sequence repeat，SSR)是一类1-6bp核苷酸基序构成的重复序列，广泛分布于真核生物基因组的编码区、非编码区，SSR标记利用简单序列重复的侧翼保守序列设计引物，经过PCR扩增，根据条带的大小来反映DNA序列的多态性。与其它分子标记如RFLP、AFLP、ISSR等相比，SSR标记具有多态性高、共显性遗传、重复性好、特异性强等特点，近年来成为遗传多样性研究、遗传作图、重要功能基因定位、分子辅助育种等领域应用最多的一种标记。传统SSR标记的开发，一般使用文库筛选法、磁珠富集法以及利用NCBI中已有EST数据库信息挖掘等。其中，前两种方法费时费力、开发成本高，第三种方法又依赖于现有NCBI中EST数据，对于EST测序少的物种其应用很有限。

截止到2011年11月21日，在NCBI数据库中可以检索到的芒属植物EST序列仅有5条，难以满足开发EST-SSR标记的需要；而现有研究中，芒属植物分子标记开发只局限在利用磁珠法或建立文库挖掘，无法满足现今芒属植物研究需求，因此，通过转录组测序获得大量EST序列信息，利用生物信息学挖掘SSR标记成为了一种高效的技术手段。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法，方法易行，操作简便，通过转录组测序获得EST序列，挖掘SSR位点信息、设计引物，构建芒属植物特异性Genic-SSR标记体系，为重要能源植物芒草的遗传学研究及分子改良等奠定基础。

本发明的另一个目的是在于提供了一种芒属植物Genic-SSR标记在芒属植物遗传多样性研究中的应用，由于Genic-SSR标记的数量多且稳定性好，分析结果准确可靠。

本发明通过以下技术方案实现：

一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法，其步骤是：

1)、芒属植物转录组序列的获得：

选取芒属植物五个种(芒、五节芒、荻、南荻、奇岗)的幼嫩叶片，分别提取总RNA，采用转录组测序方法(Illumina Solexa HiSeq2000)，得到转录组Reads，去除载体等RNA序列污染，利用拼接软件(如SOAP、iAssembler等)完成序列拼接，最终获得芒属植物五个种的非冗余Unigene-EST序列。所述的芒属植物为芒、五节芒、荻、南荻、奇岗其中的任意一种。

2)、芒属植物ESR序列中SSR位点的鉴定：

采用SSR检索软件(如：可选择SSR hunter、BatchPrimer3.0、MISA等)对上述步骤(1)得到的非冗余Unigene-EST序列进行SSR位点查找。检索的限定条件为：重复基序为2-6个碱基，且重复单元数依次大于6次，5次，4次，4次，3次；对于中间被≤50bp的间隔碱基打断的复合型SSR计为一个SSR位点，从而获得一系列含有SSR位点信息的Unigene序列(请见表1)。

表1测序产生的Unigene-EST统计信息