[发明专利]一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法及应用

权利要求书

1.一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法，其步骤是：

1)、芒属植物转录组序列的获得：

选取芒属植物的幼嫩叶片，分别提取总RNA，采用转录组测序方法，得到转录组Reads，去除载体RNA序列污染，利用拼接软件完成序列拼接，最终获得芒属植物五个种的非冗余Unigene-EST序列；

2)、芒属植物ESR序列中SSR位点的鉴定：

采用SSR检索软件对上述步骤(1)得到的非冗余Unigene-EST序列进行SSR位点查找，检索的限定条件为：重复基序为2-6个碱基，且重复单元数依次大于6次，5次，4次，4次，3次；对于中间被≤50bp的间隔碱基打断的复合型SSR计为一个SSR位点，获得一系列含有SSR位点信息的Unigene序列；

3)、芒属植物Genic-SSR引物的设计：

依据上述步骤(2)得到的含有SSR位点的Unigene序列，采用引物设计软件进行引物设计，获得一系列Genic-SSR引物，引物设计参数主要包括：引物长度为18-25bp，退火温度为50-65℃，GC含量为45-65％，PCR扩增产物长度为90-300bp；

4)、芒属植物Genic-SSR引物的扩增与筛选：

选取用于转录组测序的五个材料，用于检测芒属植物Genic-SSR标记的扩增状况以及可转移性。选取五个材料的幼叶50-100mg置于2.0mi离心管中，液氮冷却后，用研磨棒迅速将样品碾磨成粉末状，基因组提取利用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒，利用1％质量体积比的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。

采用上述步骤(3)合成的引物，以五个材料的基因组DNA进行扩增，以检测引物设计的可靠性、扩增模式及其通用性。根据扩增结果，筛选可有效扩增的芒属Genic-SSR引物。依据扩增结果，筛选出可以稳定扩增的Genic-SSR引物60对，具体如下：

ms-It-1

F：CACCAGTGTTGGATGCTGAC

R：TGTTGTCTAGCCTCCCGTCT

ms-It-2

F：ACACTGTCCCAAATCCTTCC

R：AAGAAATCTCACTCCTCTCCCC

ms-It-3

F：CTCACAGGACAAGAGAGGGG

R：GCATTCCAAAAGCATCCAGT

ms-It-4

F：TGGAGCTGTGATCCTCTTCC

R：CGGCTCAAAAACCACAAAAT

ms-It-5

F：TCCAATCTAACCTCGTTGCC

R：TGAGGTCTCGAACTGCAAAA

ms-It-6

F：CACCGTCGAGTAGGGTGG

R：CTGACGAGGGCACCAGAC

ms-It-8

F：ACCGGGGTCAGGAAGTAGAA

R：TGTTCGTCTACAACGCCACT

ms-It-9

F：CCAGCTTCTCCCACACCC

R：CACCGAAGAGCCCCTCTC

ms-It-10

F：CTTGCAGTGCCTCCGTATG

R：CCTCATCGTCGACTTCAACA

ms-It-12

F：AGTGATGGAACTGCTGGAGG

R：CTTTGAGCGTCGATCCATTT

ms-It-13

F：TGATGGTGTTGGTGATTTGG

R：ATTTGCTGTTGCTGCTGTTG

ms-It-18

F：TGGCTCCCACTATCACTTCC

R：CTTGCTGCAACAGATGGAAA

ms-It-19

F：CATGGACTCGGATCAGGACT

R：CGAGGAGGAACTTGGTGGAT

ms-It-20

F：GCAGGTTGCGATCCTAAGAC

R：GATCACCTGAAAAGGCAAGC

ms-It-21

F：CCAAGCTCTAAACAGGCTCG

R：GATGGGAGTTTACGTGGGG

ms-It-23

F：CAACCTCCTCTCCCTGATGA

R：AGACGGAGATGAATCGTTGG

ms-It-24

F：CATGGTTGAGTTCTACGCCC

R：AGAAGAGGATGGTGGGGAAG

ms-It-26

F：GGTCCATGACGAAGTCGAAG

R：CCCGGAGTTCTACTGCTACG

ms-It-27

F：AAACATGCGTGCTTTGACTG

R：TTGCCTCTTTCGTGCTACCT

ms-It-28

F：ACCACCAAAACCAAACGAAG

R：TAGAGGGGAAGAAGGGGAAG

ms-It-29

F：GGTCTAATCGCCCCGTAGAT

R：CCCTTTACTCCCGAGGAGAC

mf-ts-1

F：CAGATGAGACCAGCAGTGGA

R：ACGCCAGTCAACCATCTCTT

mf-ts-2

F：ACAGGGAGAGGGGAGAAGAA

R：TCCATCGTTTTCTGGTGTGA

mf-ts-4

F：GTGCTCTTCCGCCTGAACTA

R：TCCTCCTCCTCACCATCATC

mf-ts-5

F：CAAATGGTCGTCCCAAAGAC

R：AGAGGAAGAATGGGTGGGAG

mf-ts-6

F：ATGGCTACCACTCAGTTCGC

R：GTCGTCGTCCTCTTCAAGG

mf-ts-9

F：ACCGTCCATCCATCTGTAGC

R：GCTTCCTGGACGACTCTGTT

mf-ts-10

F：CTCGAGCGAGCTGTTCATTT

R：TGAAGATACCGTGGAGGAGG

mf-ts-11

F：CTTGTCCCTCTTCACCAAGC

R：CCTTTCTTCCAGTGGCTCAA

mf-ts-13

F：CCAGAGGGATAGGAGGAGGA

R：CACGTGTAGCAGGTCCTGAA

mf-ts-14

F：GCTCTCCGAGGTCGTGTC

R：CCTGTCTGAGGATGGTCCC

mf-ts-15

F：ACGTCCTTCTTTCTGCTGGA

R：CGTCTCTGCTCCTGGCTTTA

mf-ts-16

F：GGAACGGGGAAACCTCTG

R：TCTCTTCTCTTCTCCGTCGC

mf-ts-17

F：AAAGGGTACGGCACTGAGGT

R：GCAACGTGAACTCTGTCTGC

mf-ts-18

F：GAGGGGATCTAGATGAGGGC

R：CCAGCTCGTTTCTTCCTCAG

mf-ts-19

F：CGTCTGCGACACAAGAACAT

R：ATGATGTTGCTGGCCTTGAT

mf-ts-21

F：GGACACCTACACGGTCACCT

R：CTGCTGGCTGGTGGTGTT

mf-ts-22

F：CATGGTTGAGTTCTACGCCC

R：AGAAGAGGATGGTGGGGAAG

mf-ts-23

F：CGCACAAAAGAATGCATCAC

R：GGAACGCCACTTTCTAGCAC

mf-ts-24

F：ACCAGCACCGTCATCATCAG

R：GAACAGGTTGCCGGTGTATC

mf-ts-25

F：CTACGACCGCTGCTGCTAGT

R：TCTCCATACTGCTCTGGGCT

mf-ts-28

F：TTCCGATCTCAAGGACCAAC

R：AACCCTCCTGTCCATGATGA

mf-ts-29

F：CTGCAAGTTTCTTTGCCCTC

R：TCTGAAAAGTGGTGGTGTGC

mg-1

F：ATCAGAGAGAGGCACCTGGA

R：GAGTGAGGAGATGACCCGAC

mg-2

F：AGAAACGTGAAACCTGCTGAA

R：AAGCTGACAGCACAACAACG

mg-5

F：GGCGGATAATCAGCAAGTGT

R：GAAGAGTGGCTGGGTTGAAG

mg-6

F：GGAGAGTGAGAGCAGGGTTG

R：GTTGCCACAAATCTGGCTG

mg-7

F：ACCAAGACCAAATCTGCCAC

R：ACACAGCTACATCGGGTTCC

mg-8

F：AACTCTTTTACAACGTCAATTTGC

R：CAGCCTTTGGTTAGAGCACC

mg-17

F：AATAGGAGGCTGGCTGGTTT

R：GCAATTTGCTCCTGCACATA

mg-18

F：GCAGCAGAGAGGAGAGGAGA

R：CCCGTCGTGTTGATGTACTG

mg-19

F：TCTCCTCCAGGTTCACCATC

R：AGGTGCAAATCATCTACCGC

mg-21

F：ACAGGAACGGAGGAACTTGA

R：GATACGCCGTCGCTGAAG

mg-22

F：GATCGCTCCTTCCATTGTGT

R：AATCTCAAGTCCTCCTCCCC

mg-23

F：TGAGATTCCTCCCTCCATTG

R：GCGCTCTACTCCAGGAAAAA

mg-25

F：GCCCCTCAGATGGTTGAATA

R：TGTGGTACATCTCCCTGCAA

mg-26

F：GTCACTCTCCCCTCCCATTC

R：TGCACCCTTTACGAACTCCT

mg-27

F：CCATGGCTAAGCCTCACTTC

R：GCGCACACACACACACTACT

mg-29

F：AGCGTAAGAGGGAGGATGGT

R：GGAGCTCCTCCTCGGTGT

mg-30

F：TTGACGGTGACGATGAGGTA

R：TCAAATCTCATCAGTTCCCAAA

所述的芒属植物为芒、五节芒、荻、南荻、奇岗其中的任意一种。

2.权利要求1所述的一种芒属植物Genic-SSR标记在芒属植物遗传多样性分析中的应用；所述的芒属植物为芒、五节芒、荻、南荻、奇岗、河八王。