[发明专利]一种利用点突变进行构建的基因工程能源微生物

说明书

技术领域

本发明涉及可再生能源和生物技术领域。本发明具体涉及一种经过基因工程修饰后可通过光合作用高效生产乙醇的微生物，以及所述基因工程修饰微生物的方法和运用此基因工程微生物制备乙醇的方法。 

背景技术

石化能源为国民经济与社会发展的重要物质基础，但石化能源具有稀缺性和不可再生性，随着时间的推移，其价格必将因储量的减少和开采量的下降而上涨。此外，电力行业高度依赖煤炭资源，是造成威胁着电力供应的“煤炭矛盾”长期存在的根本原因之一。 

因此，可再生能源具有长远的发展潜力和广阔的市场前景。可再生能源产业的发展必然对相关产业的发展起到带动作用，这将使我国的国民经济结构更加合理。 

目前的液体生物燃料主要有生物燃料乙醇和生物柴油。然而，生物燃料的快速发展面临着粮食安全和土地淡水资源紧缺问题。现有技术通过燃料乙醇产业作为替代能源，但是，随着燃料乙醇产量增加，粮食供给短缺和价格上涨导致以粮食为原料的生物能源产业不能持续性发展。 

近几年大力发展的非粮燃料乙醇和生物质发电产业同样受到客观条件的制约，难以满足大规模替代化石燃料的规模和成本要求。以木薯、甜高粱、纤维素为原料的燃料乙醇产业从本质上说是以种植业为基础的，需要大规模投入可耕地、淡水、化肥以获得较高产量，而这些资源均为稀缺资源，用于替代化石能源将对整体资源环境造成巨大压力。 

对微生物进行基因工程改造来生产能源是能源产业中的一个发展方向。但现有技术中，工业上主要是利用具有乙醇代谢途径的异养微生物，例如酵母和大肠杆菌等。 

蓝藻是一种自养微生物，是目前地球上最广泛的生物体。蓝藻是单细胞 生物，没有细胞核，但细胞中央含有核物质，通常呈颗粒状或网状，染色质和色素均匀的分布在细胞质中。蓝藻的细胞质中都有内膜系统。蓝藻的细胞质中具原始的片层结构，片层上分布有光合色素叶绿素和藻胆素(包括藻蓝素和藻红素两种)及类胡萝卜素。蓝藻的叶绿素可以进行光合作用，并且其细胞可以提供光合作用所需的能量，所以蓝藻可以进行光合作用，产生自己所需要的物质，即可以自养。在蓝藻中还有一种环状DNA--质粒，在基因工程中担当了运载体的作用。和细菌一样，蓝藻属于原核生物。 

但是，自然存在的光合细菌蓝藻通常不能利用阳光和二氧化碳合成乙醇，仅在避光和无氧条件下通过发酵产生少量乙醇。 

本领域已知生产乙醇的微生物(例如大肠杆菌，酵母菌，运动发酵单细胞菌等)中存在乙醇生产的代谢途径。已知的乙醇生产代谢途径是从糖酵解途径的丙酮酸经过乙醛再到末端代谢产物乙醇，其中丙酮酸到乙醛的反应过程由丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase，PDC)催化，乙醛到乙醇的反应过程由乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)催化控制。蓝藻的基因组中不存在丙酮酸脱羧酶基因，因而不具有产生乙醇的能力。 

本发明提供了一种利用基因工程蓝藻生产乙醇的方法，经过对野生蓝藻的改造，从而使得蓝藻能够直接利用太阳光和二氧化碳生产乙醇。 

发明内容

本发明以蓝藻为宿主，将外源乙醇代谢途径的丙酮酸脱羧酶基因导入蓝藻，形成具有稳定遗传性状和较高乙醇产率的基因工程菌株，使得改造的蓝藻菌株能够利用阳光、水和二氧化碳生产乙醇。本发明还提供了基因工程蓝藻通过光合作用利用阳光、水和二氧化碳制备乙醇的方法。 

本发明提供了一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源丙酮酸脱羧酶基因。外源丙酮酸脱羧酶基因在蓝藻细胞内编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白。 

本发明使用的宿主是蓝藻，其可以是集胞藻(Synechocystis)、隐球藻属(Aphanocap s)、鱼腥藻属(Anobaena)、念珠藻属(Nostoc)、颤藻属(Oscillatoria)、聚球藻属(Synechococcus)、球藻属(Gloeocapsa)、阿格藻属(Agmmenellumm)、双歧藻属(Scytonema)、鞭枝藻属 (Mastigocladus)。本发明的蓝藻优选为集胞藻(Synechocystis)。本发明中使用的一种蓝藻菌株来自集胞藻(Synechocystis sp.)菌株PCC6803。