[发明专利]一种利用点突变进行构建的基因工程能源微生物

权利要求书

1.一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源基因，所述外源基因为丙酮酸脱羧酶基因，所述丙酮酸脱羧酶基因编码的丙酮酸脱羧酶具有对应于SEQ ID NO.1的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的苏氨酸Thr具有突变，其中所述第290位的苏氨酸Thr突变为酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)，优选突变为酪氨酸(Tyr)。

2.权利要求1所述的基因工程蓝藻，其中所述丙酮酸脱羧酶基因具有SEQ ID NO.2的碱基序列的多核苷酸，并且其中编码对应于SEQ IDNO.1氨基酸序列中自N端第290位的苏氨酸的碱基序列由TAC改变为编码酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)的碱基序列，优选其中所述编码对应于SEQ ID NO.1氨基酸序列中自N端第290位的苏氨酸的碱基序列由TAC替换为ACC、ACA、ACT或ACG，优选替换为ACC。

3.权利要求1或2所述的基因工程蓝藻，其中所述丙酮酸脱羧酶基因选自来源于运动发酵单胞菌、酿酒酵母、蓝藻和大肠杆菌的丙酮酸脱羧酶基因，优选来源于运动发酵单胞菌。

4.权利要求中1-3中任一项的基因工程蓝藻，其选自集胞藻属、隐球藻属、鱼腥藻属、念珠藻属、颤藻属、聚球菌属、球藻属、阿格藻属、双歧藻属、鞭枝藻属，优选为集胞藻，最优选为集胞藻PCC6803。

5.权利要求1-4中任一项的所述的基因工程蓝藻，其生产的乙醇由细胞中扩散到培养液中，溶液中乙醇浓度达到0.1g/L，优选的，达到0.5g/L，更优选的，达到1.5到5g/L。

6.权利要求1-5任一项的基因工程蓝藻，其保藏号为CGMCC No.5532。

7.用权利要求1-6中任一项的基因工程蓝藻制备乙醇的方法。

8.一种载体，其包括：

(a)核酸，其包含丙酮酸脱羧酶基因，其中所述丙酮酸脱羧酶基因编码的丙酮酸脱羧酶具有对应于SEQ ID NO 1的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的苏氨酸Thr具有突变；

和

(b)启动子，所述启动子与所述丙酮酸脱羧酶可操作地连接，

其中所述第290位的苏氨酸Thr突变为酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)，优选其中所述第290位的苏氨酸Thr突变为酪氨酸(Tyr)，

优选的，

其中所述丙酮酸脱羧酶基因具有SEQ ID NO.2的碱基序列的多核苷酸，并且其中编码对应于SEQ ID NO.1氨基酸序列中自N端第290位的苏氨酸的碱基序列由TAC改变为编码酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)的碱基序列，优选其中所述编码对应于SEQ ID NO.1氨基酸序列中自N端第290位的苏氨酸的碱基序列由TAC替换为ACC、ACA、ACT或ACG，优选替换为ACC。

9.一种分离的蛋白，其具有丙酮酸脱羧酶的活性，其具有对应于SEQ ID NO 1的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的苏氨酸Thr具有突变，其中所述第290位的苏氨酸Thr突变为酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)，最优选其中所述第290位的苏氨酸Thr突变为酪氨酸(Tyr)。

10.一种分离的核酸，其编码权利要求9所述的蛋白，所述核酸为具有SEQ ID NO.2的碱基序列的多核苷酸，并且其中编码对应于SEQ  DNO.1氨基酸序列中自N端第290位的苏氨酸的碱基序列由TAC改变为编码酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)的碱基序列，优选其中所述编码对应于SEQ ID NO.1氨基酸序列中自N端第290位的苏氨酸的碱基序列由TAC替换为ACC、ACA、ACT或ACG，优选替换为ACC。