[发明专利]一种用于氯霉素快速检测的直接包被ELISA方法无效
申请号: | 201110440576.6 | 申请日: | 2011-12-26 |
公开(公告)号: | CN103175955A | 公开(公告)日: | 2013-06-26 |
发明(设计)人: | 高志贤;白家磊;宁保安;彭媛;于广贵;柳明 | 申请(专利权)人: | 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 |
主分类号: | G01N33/543 | 分类号: | G01N33/543 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 300050*** | 国省代码: | 天津;12 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 用于 氯霉素 快速 检测 直接 包被 elisa 方法 | ||
技术领域
本发明涉及一种氯霉素的ELISA快速检测方法,特别涉及直接包被ELISA检测方法,属于检验
技术领域,建立的直接包被ELISA检测方法可以用于研制氯霉素免疫速测试剂盒。
背景技术
氯霉素(chloramphenicol,CAP)是一种常见的广谱抗菌药,1947年首次从链丝菌(Streptomyces venezuela)培养液中提取得到,是第一个人工合成的抗生素。氯霉素在高浓度时有很好的杀菌作用,在低浓度时能抑制多数细菌的生长,所以临床上广泛使用。对其敏感的细菌有布氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、流感杆菌、产气杆菌、伤寒杆菌、胎孤菌、沙门氏菌、克雷伯氏杆菌等。氯霉素还能对部分衣原体、立克次氏体有作用。
随着氯霉素应用的增加以及科学技术的发展,氯霉素被证明对机体有非常大的毒副作用,如遗传毒性,生殖毒性,骨髓造血机能抑制毒性,神经毒性,灰婴综合症。此外,长期微量摄入氯霉素不仅使大肠杆菌、沙门氏菌等产生抗药性,而且还会导致机体正常菌群失调,使人们易患各种疾病;但是,氯霉素在动物性食品中的残留是通过水产品、肉制品、奶、蛋等作用于人类,使人们的健康在不易察觉中受到威胁。针对这一情况,联合国粮农组织、世界卫生组织和许多国家规定限制或禁止氯霉素用于食品动物,中国农业部已将氯霉素从2000年版《中国兽药典》中删除并列为禁药。而欧盟的进口食品卫生标准是:在进口动物产品中不得检出氯霉素,其“不得检出”的含义是氯霉素含量在1μg kg-1以下,即含量在十亿分之一以下。2002年欧盟对我国出口到欧盟的动物源性产品实行禁运,就意味着我国将在欧盟市场丢掉13万吨的市场份额和造成6亿多美元的经济损失。并且由于欧盟的禁令,美国和日本等国已高度关注我国出口水产品的质量。因此动物性食品中氯霉素的残留量分析,尤其是快速、准确、高灵敏度的检测方法,近年来得到国内外食品分析工作者的高度关注。
目前氯霉素残留检测的方法主要有微生物学方法、色谱分析方法和免疫学方法。微生物法耗时长、重复性差、灵敏度低;色谱法需要昂贵的仪器,对技术人员要求高,样品前处理烦琐,成本高,分析速度慢,很难达到快速、简便和现场检测要求,更难以适应大量复杂样品的检测。而免疫分析方法,尤其是ELISA技术,不仅具有简单、快速、灵敏度高、特异性强、分析容量大等优点,而且它对使用人员的技术要求不高也不需要贵重仪器设备。
发明内容
本发明的目的是提供一种直接包被ELISA方法用于氯霉素的快速检测。
本发明的技术方案概述如下:
一种用于氯霉素快速检测直接包被ELISA方法,具体步骤如下:
1.氨基化氯霉素的合成
称取氯霉素64.6mg溶于700μL无水乙醇中,缓慢加入29.2mg锌粉,磁力搅拌器上加热反应40min。反应结束后12000rpm/min离心5min除去不溶物。采用液液萃取法对氨基化氯霉素进行纯化。
2.氨基化氯霉素的直接偶联微孔板
使用0.01mol L-1,pH9.6碳酸盐缓冲液将戊二醛(GA)稀释成6%,加入到中度吸附微孔板中,每孔200μL,37℃孵育2h。洗涤液(PBST)洗涤3次。用PBS缓冲液(80mmol L-1,pH8.0)将25nM氨基化氯霉素稀释成适当浓度加入到微孔板中,37℃孵育2h。PBST洗涤后,加0.5%氨基乙酸溶液,37℃孵育1h。洗涤后干燥保存。
3.直接包被ELISA方法的建立
在偶联好氨基化氯霉素的酶标板中,加入用含0.1%BSA的PBS稀释的50μL生物素化一抗和一系列浓度(0,0.02,0.1,1,10,25,50,100ngmL-1)的氯霉素,37℃孵育1.5h,PBST洗涤四次后,每孔加入100μL SA-HRP,37℃孵育45min。PBST洗涤6次,每孔加100μL底物显色液,37℃孵育10min后每孔中加50μL 2mol L-1 H2SO4终止反应后,用酶标仪进行读数。
本发明的有益效果:基于氨基化小分子半抗原直接偶联技术以及生物素-链霉亲和素放大系统建立了直接包被ELISA用于氯霉素检测具有较高的灵敏度和稳定性,与传统包被完全抗原的ELISA方法相比,方法更简单快速。
附图说明
图1氨基化氯霉素直接偶联聚苯乙烯微孔板示意图
图2常规ELISA检测标准曲线图
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