[发明专利]一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物及应用

说明书

技术领域

本发明属于基因治疗及新材料领域，具体涉及一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物及应用。

背景技术

基因治疗是一种利用分子生物学方法将目的基因导入患者体内，使之表达目的基因产物，从而使疾病得到治疗的技术。基因载体是基因治疗领域的核心技术之一。基因载体通常分为病毒载体和非病毒载体.在多数情况下，病毒载体的转染效率高，但存在潜在毒性、免疫原性等问题，限制了其在临床治疗中的应用；非病毒载体虽然可以克服上述问题，但是不利的生物分布以及低效的胞内运转，导致活性基因转染率低.因此提高非病毒基因载体的转染率是当前研究的关键。

阳离子聚合物，如壳聚糖、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵等是最为常用的几种非病毒基因载体聚合物材料。这些聚合物材料作为基因载体材料的主要问题是，其与DNA或RNA形成的复合物粒子易在生理环境下对一些蛋白质产生特异性的相互作用而产生吸附，从而影响其细胞内吞作用以及从内涵体或溶酶体中逃逸的速度继而影响转染效率。克服该问题的办法主要通过化学改性的方式，如通过化学修饰方法在其结构中引入PEG链段，但是该方式往往同时也消耗了聚阳离子结构中的氨基，使其压缩DNA的能力下降。

发明内容

本发明的目的是针对上述存在问题，提供一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物及应用，该功能性寡聚物制备工艺简单、易于实施；该功能性寡聚物与其它聚阳离子材料一起用作非病毒基因载体，具有低细胞毒性、良好的抗血清稳定性和高的基因转染效率，有望用于临床基因治疗。

本发明的技术方案：

一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物P(His-co-DMAEL)，由烯丙基组氨酸衍生物，2-甲基丙烯酰胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯(MA-His-OMe)和含乳糖单体2-氧-甲基-丙烯酰氧乙氧基-(2，3，4，6-四-氧-乙酰基-β-D-半乳糖)-(1-4)-2，3，6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡糖糖苷(MAEL)通过以水溶性硫代酯作为分子量调节剂自由基聚合制得，分子量为0.5-20KDa，分子量分布为1.0-2.0，MA-His-OMe和MAEL摩尔比为3-15∶1。

一种所述用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的制备方法，以MA-His-OMe和MAEL为共单体，以2，2′-偶氮二(2-甲基丙腈)(AIBN)或4，4′-偶氮(4-氰基戊酸)(ACVA)为引发剂，以4-氰基戊酸-二硫代苯酯(CPADB)为连转移剂制备，步骤如下：

1)以组氨酸甲酯和烯丙基苯并三氮唑为原料合成2-甲基丙烯酰胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯(MA-His-OMe)：

将4.8g苯并三氮唑溶解在25ml二氯甲烷中，加入1.2g二氯亚砜，搅拌30min后，加入0.86g甲基丙烯酸，继续反应2h，有机相用浓度为2摩尔/升的氢氧化钠溶液萃取三次，有机相用硫酸钠干燥12h，旋蒸除去二氯甲烷，产物用快速层析柱纯化，得到烯丙基苯并三氮唑。将1.87g烯丙基苯并三氮唑溶解在50ml二氧六环中；将1.69g组氨酸甲酯溶解在10ml去离子水中，磁力搅拌条件下，调节其pH值为8.0，然后将溶解在二氧六环中的烯丙基苯并三氮唑缓慢滴加至上述组氨酸甲酯溶液中进行反应，并用薄层色谱监测反应进程，待薄层色谱显示烯丙基苯并三氮唑消耗完全时，停止搅拌，用质量百分比浓度为10％的稀盐酸调节溶液pH值至中性，旋蒸除去二氧六环，过滤除去不溶物并旋蒸除去水相，产物经冷冻干燥后溶解在无水乙醇中并过滤，再将滤液旋干并真空干燥，得到MA-His-OMe；

2)2-氧-甲基-丙烯酰氧乙氧基-(2，3，4，6-四-氧-乙酰基-β-D-半乳糖)-(1-4)-2，3，6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡糖糖苷(MAEL)的制备：

将20g乳糖、10g无水醋酸钠加到120ml醋酸酐中，混合并在回流温度下反应2h，反应结束后将产物倒入冰水中搅拌，过滤并用水洗涤固体三次，置于空气中干燥，然后用乙醇重结晶得到八乙酰基乳糖；在20ml二氯甲烷中，加入5g八酰基乳糖和4.8ml甲基丙烯酸羟乙酯以及2mL三氟化硼-乙醚，在冰水浴中反应2h，然后室温反应12h，反应结束后加入20ml去离子水，分离后依次用水、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤二氯甲烷相至中性，然后用硫酸钠干燥，旋蒸除去二氯甲烷并用色谱柱分离，得到MAEL；

3)用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的制备：