[发明专利]一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物及应用

权利要求书

1.一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物P(His-co-DMAEL)，其特征在于：由烯丙基组氨酸衍生物，2-甲基丙烯酰胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯(MA-His-OMe)和含乳糖单体2-氧-甲基-丙烯酰氧乙氧基-(2，3，4，6-四-氧-乙酰基-β-D-半乳糖)-(1-4)-2，3，6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡糖糖苷(MAEL)通过以水溶性硫代酯作为分子量调节剂自由基聚合制得，分子量为0.5-20KDa，分子量分布为1.0-2.0，MA-His-OMe和MAEL摩尔比为3-15∶1。

2.一种如权利要求1所述用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的制备方法，其特征在于以MA-His-OMe和MAEL为共单体，以2，2′-偶氮二(2-甲基丙腈)(AIBN)或4，4′-偶氮(4-氰基戊酸)(ACVA)为引发剂，以4-氰基戊酸-二硫代苯酯(CPADB)为连转移剂制备，步骤如下：

1)以组氨酸甲酯和烯丙基苯并三氮唑为原料合成2-甲基丙烯酰胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯(MA-His-OMe)：

将4.8g苯并三氮唑溶解在25ml二氯甲烷中，加入1.2g二氯亚砜，搅拌30min后，加入0.86g甲基丙烯酸，继续反应2h，有机相用浓度为2摩尔/升的氢氧化钠溶液萃取三次，有机相用硫酸钠干燥12h，旋蒸除去二氯甲烷，产物用快速层析柱纯化，得到烯丙基苯并三氮唑。将1.87g烯丙基苯并三氮唑溶解在50ml二氧六环中；将1.69g组氨酸甲酯溶解在10ml去离子水中，磁力搅拌条件下，调节其pH值为8.0，然后将溶解在二氧六环中的烯丙基苯并三氮唑缓慢滴加至上述组氨酸甲酯溶液中进行反应，并用薄层色谱监测反应进程，待薄层色谱显示烯丙基苯并三氮唑消耗完全时，停止搅拌，用质量百分比浓度为10％的稀盐酸调节溶液pH值至中性，旋蒸除去二氧六环，过滤除去不溶物并旋蒸除去水相，产物经冷冻干燥后溶解在无水乙醇中并过滤，再将滤液旋干并真空干燥，得到MA-His-OMe；

2)2-氧-甲基-丙烯酰氧乙氧基-(2，3，4，6-四-氧-乙酰基-β-D-半乳糖)-(1-4)-2，3，6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡糖糖苷(MAEL)的制备：

将20g乳糖、10g无水醋酸钠加到120ml醋酸酐中，混合并在回流温度下反应2h，反应结束后将产物倒入冰水中搅拌，过滤并用水洗涤固体三次，置于空气中干燥，然后用乙醇重结晶得到八乙酰基乳糖；在20ml二氯甲烷中，加入5g八酰基乳糖和4.8ml甲基丙烯酸羟乙酯以及2mL三氟化硼-乙醚，在冰水浴中反应2h，然后室温反应12h，反应结束后加入20ml去离子水，分离后依次用水、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤二氯甲烷相至中性，然后用硫酸钠干燥，旋蒸除去二氯甲烷，用色谱柱分离，得到MAEL；

3)用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的制备：

0.96g MA-His-OMe、0.5g MAEL、0.0075g ACVA和0.023g CPADB溶解在10ml N，N′-二甲基甲酰胺中，冷冻除氧三次后密封置于70℃水浴中反应48小时，反应结束后，先用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析48h并冷冻干燥，然后将产物溶解在无水乙醇中，加入1ml质量百分比浓度为30％甲醇钠的甲醇溶液并反应2小时，再用截留分子量为3500的透析袋在去离子水透析48小时并冷冻干燥，得到功能性寡聚物P(His-co-DMAEL)。

3.一种如权利要求1所述用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的应用，其特征在于：将该功能性寡聚物与聚阳离子材料混合制备DNA或RNA复合物，用作非病毒基因载体材料，并进行细胞转染试验。

4.根据权利要求3所述用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的应用，其特征在于：所述聚阳离子材料包括壳聚糖(以下简称为CS)、聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)和聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(PDMMC)。

5.根据权利要求3所述用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的应用，其特征在于：所述DNA或RNA复合物的制备方法是，先将0.1-2.0μg/μl的功能性寡聚物与DNA或RNA室温下混合均匀并放置15分钟；然后再将0.1-2.0μg/μl的聚阳离子材料溶液滴加入上述DNA混合液中，振动搅拌10秒使溶液混合均匀并放置15分钟，即可制得N/P＝0.25∶1-40∶1比的DNA或RNA复合物。