[发明专利]鸡球虫ADF重组卡介苗及制备方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种鸡球虫ADF重组卡介苗，同时还提供了该疫苗的的制备方法，属基因工程技术领域。

背景技术

鸡球虫病是一种由艾美尔属的一种单细胞寄生性原虫引起的，全球性的原虫病，是严重危害养鸡业的重要疾病之一，其中以柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)的危害最为严重。E.tenella主要寄生于鸡的盲肠上皮细胞。其裂殖体在盲肠上皮细胞内大量繁殖，严重破坏肠粘膜，盲肠肿胀出血，病鸡明显消瘦、食欲减退、发育停滞甚至死亡。该病分布广泛，长期以来主要依赖于药物和球虫活苗进行防治，但最近几年由于耐药虫株的出现，以及药物残留对人们的身体健康造成威胁而研发新药成本高、周期长，同时球虫活苗虫种毒力返强等潜在危害问题的存在，使人们将目光转向了分子疫苗。人们曾尝试过将球虫的抗原基因在不同的表达环境进行表达，但目前仍没有一种抗原基因能够提供完全的免疫保护，而且受表达系统的限制，以大肠杆菌为原核表达系统的重组蛋白抗原性较差；痘病毒载体疫苗由于病毒的特性, 只能进行一次免疫,无法满足球虫免疫的要求; 真核载体疫苗虽然可以引起机体的细胞免疫, 但是免疫途径比较麻烦; 沙门氏菌载体在实验室应用相对来说比较安全, 但若应用于临床, 就必须考虑安全性问题。因此，有必要采用基因工程方法发展一种高效，廉价的新型鸡球虫疫苗。

目前，卡介苗是世界上应用最为广泛和安全的疫苗。因与其它细菌载体和病毒载体相比有不可比拟的优势而成为重组活载体疫苗的首选。它本身是一种很好的非特异免疫增强剂,能增加机体免疫功能，免疫持久，单次接种即能诱导机体产生的细胞免疫和体液免疫,副作用小，并且易于生产,价格低廉,适宜于广大农村。

肌动蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor，ADF)是申请者在柔嫩艾美耳球虫cDNA表达文库和制备柔嫩艾美耳球虫子孢子特异性单抗的基础上，利用特异性单抗对柔嫩艾美耳球虫cDNA表达文库筛选获得的。ADF序列含有357bp的开放阅读框，可编码118个氨基酸，分子量为13.34kDa。其序列与其他生物体的ADF蛋白有高度的同源性，且与刚地弓形虫ADF同源性最高。CDD分析显示该蛋白具有肌动蛋白解聚因子保守结构域特征。含有肌动蛋白结合位点， F-actin 结合位点。 细胞骨架中的肌动蛋白参与了一系列重要生理活动，如肌肉收缩、胞质环流、细胞运动、胞质分裂等。这些过程的发生除了需要肌动蛋白以外，还需要一些与之结合的调节蛋白参与，如肌动蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor，ADF)等，在一定条件下可以使肌动蛋白微丝解聚。因此柔嫩艾美耳球虫ADF基因对研究虫体的运动和侵入有重要意义。并且侵入蛋白也是重要的疫苗候选分子。ADF亚单位疫苗和核酸疫苗对鸡柔嫩艾美耳球虫的免疫保护试验表明，其有一定的免疫保护作用，但球虫ADF重组卡介苗尚无报导。

发明内容

本发明提供一种鸡球虫ADF重组卡介苗，为两种抗鸡柔嫩艾美耳球虫的新型活载体疫苗，解决了目前鸡球虫尚无理想疫苗的问题。

本发明还进一步公开了鸡球虫ADF重组卡介苗的制备方法，适用于工业化生产。

一、本发明提供的鸡球虫ADF重组卡介苗，是通过以下方法制成的：

首先获得鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊，提取RNA，反转录成cDNA，根据已克隆的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，与PMD-18T载体连接进行克隆，测序鉴定正确后，酶切回收目的片段，再分别与用同种酶进行酶切反应的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体PMV261和整合表达载体PMV361相连，连接正确的重组质粒转化到BCG中，经抗性筛选和PCR鉴定，获得阳性鸡柔嫩艾美耳球虫重组卡介苗。

二、所述的鸡球虫ADF重组卡介苗，包括：

穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗和整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗，将其命名为rBCG PMV261-ADF和rBCG PMV361-ADF。

三、本发明公开的穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗的制备方法，包括以下步骤：