[发明专利]鸡球虫ADF重组卡介苗及制备方法

权利要求书

1.一种鸡球虫ADF重组卡介苗，是通过以下方法制成的：首先获得鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊，提取RNA，反转录成cDNA，根据已克隆的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，与PMD-18T载体连接进行克隆，测序鉴定正确后，酶切回收目的片段，再分别与用同种酶进行酶切反应的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体PMV261和整合表达载体PMV361相连，连接正确的重组质粒转化到BCG中，经抗性筛选和PCR鉴定，获得阳性鸡柔嫩艾美耳球虫重组卡介苗。

2. 权利要求1所述的鸡球虫ADF重组卡介苗，包括穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗和整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗。

3. 权利要求2所述穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗的制备方法，包括以下步骤：

将构建的柔嫩艾美耳球虫杂交虫株F2cDNA表达文库中筛选出ADF基因，根据已克隆的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，TA克隆；

测序鉴定正确的质粒进行酶切，回收目的片段，与同种酶切的pMV261穿梭表达载体进行连接，将连接产物转入DH5α感受态细胞中，提取质粒，将重组质粒ADF-261经电穿孔转化到卡介苗中，37℃培养至对数生长期后，挑去菌落，筛选BCG重组子，PCR方法证实为阳性克隆后，45℃热诱导表达，对该表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Western blotting 鉴定；

其中，

上游引物AD1： 5 AGCTGCAG ATG GCG AGC GGA ATG CCA GTC 3；

下游引物AD：5 GAATCGAT CTAATGGAGCACGCTTAGGTC3；。

4. 权利要求2所述整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗的制备方法，包括以下步骤：

根据已克隆的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列的开放阅读框设计引物并引入酶切位点，进行PCR，TA克隆，对测序鉴定正确的质粒进行双酶切，回收目的片段，与同种酶切的pMV361整合表达载体进行连接，转入DH5α感受态细胞中，提取质粒，将重组质粒ADF-361经电穿孔法转化到卡介苗中，37℃培养至对数生长期后，挑去菌落，筛选BCG重组子，PCR方法证实为阳性克隆后，45℃热诱导表达，对该表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Western blotting 鉴定；

其中，

上游引物AD2：5 AGCAGCTGATGGCGAGCGGAATGCCAGTC3；

下游引物AD：5 GAATCGAT CTAATGGAGCACGCTTAGGTC3。