[发明专利]一种碱性蛋白酶的生产方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种碱性蛋白酶的生产方法。

背景技术

碱性蛋白酶(Alkaline Protease)属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，可以在碱性条件下水解蛋白质肽键，其最适作用pH一般为9～11，主要应用于加酶洗涤剂工业，在制革、丝绸、饲料、医药、食品、环保等工业也有广泛的应用。

目前，在世界范围内蛋白分解酶是工业酶中用得最多的酶，约占酶总量的60％，其中碱性蛋白酶就占25％。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用，吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究。

研究室的前期研究通过低能N⁺离子注入技术诱变选育得到一株高产碱性蛋白酶的嗜碱芽孢杆菌，并通过正交试验确定其最佳发酵培养基，其7L规模发酵罐酶活力达到36000U/mL。

清液发酵指培养基中不含固体不溶物，其发酵过程中传质效果要优于粗料发酵，且降低后续分离纯化的难度，可以极大降低生产成本。

补料分批发酵与不补料分批发酵相比，特点在于使发酵系统中维持较低的基质浓度。低基质浓度的优点：①可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧矛盾；②避免在培养基中积累有毒代谢物，即代谢阻遏。

本发明中菌株的发酵周期55小时左右，产酶高峰期在对数生长末期，此时营养物质浓度较低，不利于产酶。采用高营养物质浓度发酵液发酵则会产生阻遏效应，抑制菌体的生长，同样不利于产酶。同时发酵培养基中氮源采用棉籽饼粉，虽利于产酶，但为粗料发酵，原料利用率低，且含有大量微小颗粒，给后期酶的分离纯化带来困难。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种碱性蛋白酶的生产方法，本发明利用碱性蛋白酶高产菌株发酵生产碱性蛋白酶，采用清液发酵与补料分批发酵相结合的方法，本方法有效提高嗜碱芽孢杆菌产碱性蛋白酶的能力。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种碱性蛋白酶的生产方法，生产过程采用补料分批发酵的方法。

而且，发酵采用清液发酵。

而且，发酵所用微生物为嗜碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus Y-22，保藏编号为：CGMCC No.5313，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

而且，发酵步骤如下：

(1)种子的培养：从斜面上挑取一环新培养的嗜碱性芽孢杆菌Y-22接入种子培养液中(50mL种子培养基/250mL三角瓶)，200r/min，34℃培养12h；

(2)发酵罐培养：5％v/v接种量转接至液体发酵培养基；温度：34℃；转速：250～450r/min；通风量：1∶0.5～1∶1.5。发酵过程中自动流加氨水及20％v/v的盐酸，使发酵液pH值维持在7.0；

(3)补料分批发酵：在碱性蛋白酶高产菌株发酵产碱性蛋白酶的过程中按一定的比生长速率流加补料培养基，发酵10-30小时控制比生长速率0.12h^-1，30-55小时控制比生长速率0.6h^-1。

而且，所用发酵培养基配方为g/L：酵母浸粉17，麦芽糊精100g/L、柠檬酸钠3g/L、氯化钙2.6g/L、K₂HPO₄18g/L、pH自然，标准棉籽饼粉水解液150mL/L。

而且，所用补料培养基配方为：麦芽糊精600g/L、柠檬酸钠3g/L、氯化钙2.6g/L、K₂HPO₄18g/L、pH自然，标准棉籽饼粉水解液800mL/L。

而且，所述标准棉籽饼粉水解液为棉籽饼粉经物理作用及酶水解后得到的上清液。

而且，所述标准棉籽饼粉水解液的制备方法步骤如下：

(1)棉籽饼粉加干重2-5倍的水，高压蒸煮20-30分钟，除去对菌体生长有害的棉酚；

(2)加入棉籽饼粉干重1-3％(w/w)复合酶制剂，45℃，120r/min，搅拌处理120分钟；

(3)板框过滤，滤液即为棉籽饼粉酶水解液；

(4)将棉籽饼粉酶水解液中蛋白浓度稀释为25g/L，即为标准棉籽饼粉酶水解液。

而且，所述复合酶制剂为蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的混合物。

而且，所述复配比例为蛋白酶∶纤维素酶∶木聚糖酶∶果胶酶＝3∶1.5∶2.5∶2。

本发明的优点及积极效果是：