[发明专利]一种荧光定量PCR检测AAPB的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及一种荧光定量PCR (聚合酶链式反应)检测AAPB的方法。

背景技术

好氧不产氧光合细菌，Aerobic anoxygenic phototrophic bacteria (AAPB)是一类能利用光能进行光合作用的细菌。AAPB 有着独特的生理生态特征：(1)专性好氧；(2)营光合作用生长却不全依赖于光；(3)细菌叶绿素a (BChla)含量比厌氧光合细菌低很多，含有类胡萝卜素。

AAPB在水生态系统中有着特殊的意义，现有的文献表明：(1)AAPB分布广泛，在海洋、酸性矿山污水、热泉、江河和河口以及湖泊中都有发现；(2)在水生生态系统中占有较大比例，如在海洋中占总细菌的10%，(通过荧光显微镜发现在太平洋中占总原核细胞数的5%，在大西洋中则是2%-16%)，河口中占34%，在某些高山淡水湖泊中则超过50%，但是也有文献表明AAPB在15公里的近海的18个点位中一般只在1%左右，最多也不超过3%；(3) AAPB在海洋生态系统的碳循环中有重要作用。

将Bchla (细菌叶绿素a)产生的光合能量转换为呼吸消耗所需的相应的碳量，在陆架海和大洋分别为0.27 mgC m^-3 day^-1和0.11 mgC m^-3 day^-1相当于各自海区初级生产力的2.4%和5.4%。根据政府间气候委员会 (IPCC) 的模型，海洋吸收和释放二氧化碳的差值大约是2％，所以基于BChla的光能利用足以改变一个海区碳的“汇”“源”格局(Jiao et al., 2010 “Significant roles of bacteriochlorophylla supplemental to chlorophylla in the ocean” The ISME Journal, 4(4): 595-597)。现在世界各国极其关注全球碳排放。截止到2009年2月，一共有183个国家通过了《京都议定书》。因此研究AAPB对于我们理解全球碳排放、气候变化、温室效应等有重要现实意义。但是以上研究几乎都是针对海洋而针对湖泊，水库，河流的研究较少，对AAPB在淡水水生态系统中碳循环作用知之甚少。现有技术使用流式细胞仪检测AAPB，需要大型仪器流式细胞仪。流式细胞仪检测方法主要运用于海洋水体中，相对于海洋水体湖泊、河流等水体中颗粒性物质浓度更高，粒径更大对流式细胞仪有较大损耗；而且流式细胞仪价格昂贵一般科研机构不具备。使用的试剂DAPI染料等是强烈致癌物质，对人体和环境都不友好，现有技术中缺乏一种快捷简便、安全的检测AAPB的方法。

因此，AAPB检测方法还有待发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种荧光定量PCR检测AAPB的方法，旨在解决现有的检测AAPB的技术操作困难并对环境不友好的问题。

本发明的技术方案如下：

一种荧光定量PCR检测AAPB的方法，其中，根据AAPB的pufM基因片段设计出的引物，进行实时荧光定量PCR检测；其中，所述pufM引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，反向引物具有序列表中SEQ ID NO.2的核苷酸序列。

所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其中，所述荧光定量PCR检测AAPB的方法具体包括以下步骤：

S1、采集水体DNA样品：将采集到的水体样品经过过滤，得到水体中的细菌，并对细菌进行总DNA的提取纯化，得到水体样品DNA；

S2、建立AAPB荧光定量PCR标准曲线：取好氧不产氧光合细菌作为标准菌株，提取其DNA并稀释成多个浓度梯度，用好氧不产氧异养细菌pufM基因引物对，分别以各个浓度的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值绘制荧光定量PCR标准曲线；

S3、建立水体总细菌荧光定量PCR标准曲线：

将大肠杆菌作为标准菌株，提取DNA并稀释成多个浓度梯度，按照步骤S2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，用总菌引物分别以各个浓度的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值绘制荧光定量PCR标准曲线；

S4、样品检测：