[发明专利]一种荧光定量PCR检测AAPB的方法

权利要求书

1.一种荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，根据AAPB的pufM基因片段设计出的引物，进行实时荧光定量PCR检测；其中，所述pufM引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，反向引物具有序列表中SEQ ID NO.2的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR检测AAPB的方法具体包括以下步骤：

S1、采集水体DNA样品：将采集到的水体样品经过过滤，得到水体中的细菌，并对细菌进行总DNA的提取纯化，得到水体样品DNA；

S2、建立AAPB荧光定量PCR标准曲线：取好氧不产氧光合细菌作为标准菌株，提取其DNA并稀释成多个浓度梯度，用好氧不产氧异养细菌pufM基因引物对，分别以各个浓度的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值绘制荧光定量PCR标准曲线；

S3、建立水体总细菌荧光定量PCR标准曲线：

将大肠杆菌作为标准菌株，提取DNA并稀释成多个浓度梯度，按照步骤S2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，用总菌引物分别以各个浓度的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值绘制荧光定量PCR标准曲线；

S4、样品检测：

取步骤S1中得到的水体样本DNA作为模板，按步骤S2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，分别用总菌引物和pufM基因引物，进行实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增；其中阴性对照采用去离子水，阳性对照采用好氧不产氧光合细菌的DNA；将DNA样本的循环阈值C(t)与标准曲线对照，得到DNA样本中的pufM基因片段拷贝浓度。

3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，所述步骤S1具体为：

将采集到的水体样品经过5 μm的微孔滤膜过滤，得到的滤液再用0.2 μm的微孔滤膜进行过滤；对0.2 μm微孔滤膜上的物质进行细菌的总DNA提取纯化，得到水体样品DNA。

4.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，所述步骤S3中的总菌引物，其正向引物具有序列表中SEQ ID NO.3的核苷酸序列，反向引物具有序列表中SEQ ID NO.4的核苷酸序列。

5.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，步骤S2中所述荧光定量PCR检测的反应体系为：

20 μL SYBR-Green Master Mix，1 μL 纯化后的DNA样品，用于扩增的引物对，每条引物浓度10 pmol、添加量为0.4 μL，以去离子水补足至25 μL的终体积。

6.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，步骤S2中所述实时荧光定量PCR的反应程序为：50℃ 2 min，95℃ 30 s，接着进行40个循环，每个循环包括94℃ 10 s，54℃ 20 s 和72℃ 10 s。