[发明专利]结核杆菌的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法，特别是涉及结核杆菌的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。

背景技术

结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。结核病又称为痨病和“白色瘟疫”，是一种古老的传染病，自有人类以来就有结核病。迄今为止，结核病仍为严重的传染病。据统计，世界人口中1/3感染有结核分枝杆菌。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，约三分之一的人口已感染了结核杆菌，受感染人数超过4亿。我国现有肺结核病人约500万，主要集中在25岁及以上人群，其中涂阳肺结核病人150万，每年约有13万人死于结核病，死亡平均年龄为55.2岁。据研究，受结核菌感染的人群中，10％的人会发展为结核病。如果不采取有效的控制措施，在未来的10年，我国可能有近5000万的结核病感染者。

结核病是青年人容易感染的一种慢性和缓发的传染病，一年四季都可以发病，15岁到35岁的青少年是结核病的高发峰年龄；结核病的潜伏期4-8周；80％的结核病感染发生在肺部，其它部位(颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼)也可继发感染；人与人之间呼吸道传播是该病传染的主要方式；传染源为接触排菌的肺结核患者。

环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi(Notomi T，Okayama H，MasubuchiH，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res 2000；28(12)：63.)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人(Imai M，Ninomiya A，Minekawa H，et al.Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method.J Virol Methods.2007；141(2)：173-80.)利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuyuki Hayashi等人(Hayashi N，Arai R，Tada S，Taguchi H，Ogawa Y.Detection and identification of Brettanomyces/Dekkera sp.yeasts with a loop-mediated isothermal amplification method.Food Microbiol.2007；24(7-8)：778-85.)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其它与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、虹彩病毒、人类疮疹病毒8型、造血组织坏死病毒(工HHNV)、番茄斑萎病毒和番茄黄化曲叶病毒等。但是迄今为止，市场上还未见用于检测结核杆菌的LAMP专用引物与试剂盒问世。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性和灵敏度较高的用于检测结核杆菌的LAMP检测专用引物。

本发明所提供的用于对结核杆菌进行LAMP检测的专用引物，是根据如序列表中序列1所示的结核杆菌的特异性保守靶序列IS6110设计的，用以定性检测待测样品中的结核杆菌。

具体来讲，所述用于对结核杆菌进行LAMP检测的专用引物命名为JH164引物组合，由以下三组引物对混合得到，第一组引物对：引物1(F3)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，引物2(B3)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；第二组引物对：引物3(FIP)，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，引物4(BIP)，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；第三组引物对：引物5(LF)，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，引物6(LB)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。

所述JH164引物组合中各引物对(FIP和BIP)∶(LF和LB)∶(F3和B3)的摩尔比为40∶20∶5。