[发明专利]结核杆菌的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒

权利要求书

1.用于对结核杆菌进行LAMP检测的专用引物，是根据如序列表中序列1所示的结核杆菌的特异性保守靶序列IS6110设计的，用以定性检测待测样品中的结核杆菌。

2.根据权利要求1所述的专用引物，其特征在于：所述用于对结核杆菌进行LAMP检测的专用引物命名为JH164引物组合，由以下三组引物对混合得到，第一组引物对：引物1(F3)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，引物2(B3)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；第二组引物对：引物3(FIP)，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，引物4(BIP)，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；第三组引物对：引物5(LF)，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，引物6(LB)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。

3.根据权利要求2所述的专用引物，其特征在于：所述JH164引物组合中各引物对(FIP和BIP)∶(LF和LB)∶(F3和B3)的摩尔比为40∶20∶5。

4.一种结核杆菌的LAMP检测方法，包括以下步骤：

1)以待测样品的基因组DNA为模板，在权利要求1或2或3所述专用引物的引导下进行LAMP扩增；所述待测样品为纯菌液、痰液或脑脊液等；

2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在结核杆菌，橙色表示待测样品中不存在结核杆菌；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在结核杆菌，浊度无变化表示待测样品中不存在结核杆菌。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1)中的25μl LAMP反应体系可包括：待测物的基因组DNA 2μl，20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％ Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mMdNTP each，8U Bst DNA polymerase，引物加入量为：40pmol序列表中序列2(FIP)和序列3(BIP)所示引物，20pmol序列表中序列4(LF)和序列5(LB)所示引物，5pmol序列表中序列6(F3)和序列7(B3)所示引物。

6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1)中的LAMP扩增条件为：置60-65℃恒温40-60min，优选为50min，。

7.根据权利要求4或5或6所述的检测方法，其特征在于：所述步骤2)中钙黄绿素指示剂的添加量为1μl，包含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰。

8.一种结核杆菌的LAMP检测试剂盒，包含有权利要求1或2或3所述的结核杆菌的LAMP检测的专用引物。

9.根据权利要求8所述结核杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为结核杆菌的基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系，如双蒸水。

10.根据权利要求8或9所述结核杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括：20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，JH164引物组合：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3；Bst DNA聚合酶、双蒸水、钙黄绿素指示剂和结核杆菌的基因组DNA。