[发明专利]旋毛虫的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒

权利要求书

1.用于对旋毛虫进行LAMP检测的专用引物，是根据如序列表中序列1所示的旋毛虫的特异性保守基因sb4重复序列设计的，用以定性检测待测样品中的旋毛虫。

2.根据权利要求1所述的专用引物，其特征在于：为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1(F3)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，引物2(B3)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；第二组引物对：引物3(FIP)，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，引物4(BIP)，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；第三组引物对：引物5(LF)，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，引物6(LB)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。

3.根据权利要求2所述的专用引物，其特征在于：所述引物组合中各引物对(FIP和BIP)∶(LF和LB)∶(F3和B3)的摩尔比为40∶20∶5。

4.一种旋毛虫的LAMP检测方法，包括以下步骤：

1)以待测物的基因组DNA为模板，在权利要求1或2或3所述引物的引导下进行LAMP扩增；待测物为肌肉、血液或粪便等；

2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在旋毛虫，橙色表示待测样品中不存在旋毛虫；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在旋毛虫，浊度无变化表示待测样品中不存在旋毛虫。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的；所述25μl LAMP反应体系包括：待测物的基因组DNA 2μl，20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA polymerase，引物加入量为：40pmol FIP和BIP所示引物，20pmolLF和LB所示引物，5pmol F3和B3所示引物。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的LAMP扩增条件为：置60-65℃恒温45-55min，优选为50min。

7.根据权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中钙黄绿素指示剂的添加量为1μl，包含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰。

8.一种用于对旋毛虫进行LAMP检测的试剂盒，包括权利要求1或2或3所述用于对旋毛虫进行LAMP检测的引物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为旋毛虫的基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系(如双蒸水)。

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括：20mMTris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween 20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3，钙黄绿素指示剂，旋毛虫的基因组DNA和双蒸水。